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細胞復蘇步驟注意事項

來源:上海科興商貿有限公司   2012年09月17日 10:18  

細胞復蘇步驟注意事項:

【材料】1.常規(guī)細胞培養(yǎng)儀器設備恒溫水浴振蕩器。

2.培養(yǎng)液(DMEM)胎牛血清(CBS)二甲基亞砜(DMSO)【操作程序】1.細胞實驗室進行常規(guī)消毒,紫外照射40min以上。2.培養(yǎng)液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒溫水浴箱370C預熱20min,備用。

3.二甲基亞砜(DMSO)在40C冰箱中冷藏30min,備用。

4.從液氮保存罐中取出凍存管,立即放入400C水浴中,快速搖晃,直至凍存液*融化。

5.將細胞懸液移入15ml離心管,緩慢加入4ml培養(yǎng)液,離心(1000r/min,5min)。

6.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞,調整細胞濃度,方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.記錄復蘇日期。

【注意事項】1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套,護目鏡。此項尤為重要,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸。

2.凍存液的問題:凍存液的配置已是常識,在這里不作詳述,但二甲基亞砜(DMSO)對細胞不是*無毒副作用,在常溫下,二甲基亞砜對細胞的毒副作較大,因此,必須在1-2min內使凍存液*融化。如果復蘇溫度太慢,會造成細胞的損傷,二甲基亞砜(DMSO)選擇進口產品。

3.離心前須加入少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度,以減少對細胞的損傷。

4.離心問題:目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),第二天換液。因為離心的目的是兩個,去除DMSO,去除死細胞,這個是標準流程,但對一般人來說,把握不好離心轉速和時間,轉的不夠活細胞沉底的少,細胞就全被扔掉了,轉過了活細胞會受壓過大,死亡。此外在操作過程中容易污染,所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜(DMSO),DMSO對細胞有一定的毒副作用,所以須將離心后的液體前倒凈,且一定倒干凈。我在試驗中按照常規(guī)的離心分裝的方法進行復蘇,結果無有異常。

5.細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml-15m培養(yǎng)液,而在我的試驗中的經驗總結為培養(yǎng)基越少細胞越容易貼附。

6.復蘇細胞分裝的問題:試驗中我的經驗總結為復蘇1管細胞一般可分裝到1-2只培養(yǎng)瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。7.加培養(yǎng)基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,從如果你加培養(yǎng)基的太少,那么DMSO的濃度就會比較大,就會影響細胞生長,從以前的資料來看,DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響,還有一個說法是1%。所以如果你的凍存液的濃度是10%DMSO的話那么加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時,細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶,能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等,能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑,可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下,能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

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