藥品無菌檢查出現(xiàn)陽性結(jié)果的原因復(fù)雜，主要和實驗環(huán)境、實驗用品、操作人員無菌操作規(guī)范程度及供試品真實的無菌水平等有關(guān)，本文重點闡述與出現(xiàn)陽性結(jié)果有關(guān)的諸多實驗環(huán)境等因素，意在為微生物檢驗人員作陽性結(jié)果原因分析時提供參考。

一．相關(guān)因素

1．實驗用器皿等相關(guān)因素：

實驗用器皿、用具等因素可從包括藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量（無菌配制，非無菌配制）、培養(yǎng)器的無菌性能、培養(yǎng)基的無菌性等方面考慮。重點介紹藥品外包裝上的染菌量、酒精棉球等消毒劑的含菌量（無菌配制，非無菌配制）測試

2．實驗環(huán)境因素：

 無菌檢查過程中的空氣沉降菌、 工作臺面的染菌量、無菌工作服染菌量。

3．實驗人員因素：

操作人員雙手染菌量、不規(guī)范操作。

二．驗證方法

1．無菌檢查實驗用器皿等 

1.1首先應(yīng)目視檢查供試品、無菌培養(yǎng)器包裝有否開裂、破損。發(fā)現(xiàn)包裝破損的不得使用；

1.2培養(yǎng)基包裝的塞子是否松動，有松動現(xiàn)象的應(yīng)不得使用；

1.3藥品外包裝的消毒有效性

藥品外包裝上的染菌量不容忽視，必須經(jīng)充分消毒后轉(zhuǎn)移到無菌操作臺面。

藥品外包裝上的染菌量驗證可采用下述方法進行：

（1）取供試品外包裝未經(jīng)消毒直接置紫外燈下30分鐘后取樣。

（2）取供試品經(jīng)酒精棉球或消毒液浸泡一定時間，擦干后再暴露在紫外燈下30分鐘后取樣。

供試液制備：

取供試品3個包裝，分別用無菌鑷子夾住經(jīng)無菌氯化鈉溶液濕潤的無菌棉球，擦拭一周，棉球置100ml無菌氯化鈉溶液，另取一塊無菌棉球重復(fù)擦拭一遍，制成供試液。供試液振搖1分鐘經(jīng)開放式濾膜法過濾、取濾膜培養(yǎng)、計數(shù)，得到的數(shù)據(jù)即可比較藥品外包裝2種消毒方法的消毒效果。

1.4酒精棉球等消毒劑的含菌量測試

酒精棉球等消毒劑的含菌量測試，可分別測試無菌配制及非無菌配制的消毒劑的含菌量，還需注意新鮮配制的與反復(fù)使用的消毒劑含菌量的變化。

測試方法可采用開放式濾膜法過濾、取濾膜培養(yǎng)、計數(shù)，得到的數(shù)據(jù)即可比較不同方法配制及不同時間使用的消毒劑的含菌量。

1.4.1無菌室常用消毒劑的配制：

無菌室使用的消毒劑應(yīng)在凈化臺面上配制，需過濾的應(yīng)準(zhǔn)備已滅菌的濾器。配好的消毒劑應(yīng)在盛放的瓶子上標(biāo)明名稱、配制日期、失效期等。

1.4.1.1 75％酒精棉球：

取95％的酒精，加注射用水制成75％的酒精溶液，取該溶液用0.22μm微孔濾膜過濾后放入已滅菌的瓶中，備用。取經(jīng)121℃30分鐘滅菌的脫脂棉球，置無菌包裝內(nèi)，倒入75％的酒精溶液，即得。該酒精棉球在48h內(nèi)使用。如取成品消毒酒精配制的，脫脂棉球需經(jīng)121℃30分鐘滅菌。

1.4.1.2 0.1％新潔爾滅溶液的配制：

取注射用水，加入不同濃度的新潔爾滅溶液，使成0.1％濃度，并攪拌均勻，將配制好的溶液用0.22μm微孔濾膜過濾后放入已滅菌的瓶中，備用。此溶液應(yīng)在48h內(nèi)使用。

2實驗環(huán)境因素 無菌檢查過程中的空氣沉降菌測試、 工作臺面的染菌量測試、無菌工作服染菌量測試

2.1無菌實驗應(yīng)選用10000級環(huán)境下置100級凈化臺或操作臺面的無菌室或無菌隔離器中進行。無菌室的潔凈度測試可參照潔凈室潔凈度檢查的方法進行并判定。

2.2無菌檢查過程中的無菌室環(huán)境監(jiān)測，可采用空氣沉降菌測試來完成。

2.3工作臺面的染菌量測試

取樣時間，按正常的程序消毒，待實驗結(jié)束后取樣。

供試液制備：取5×5cm的滅菌標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格板，放在凈化臺操作區(qū)表面，用浸有無菌氯化鈉溶液的棉拭子在規(guī)格板內(nèi)來回涂抹，棉拭子剪去手握部位后放入100ml無菌氯化鈉溶液中制成供試液，以同法操作采樣2個表面。振搖供試液，備用。供試液經(jīng)開放式濾膜法過濾、 取濾膜培養(yǎng)、計數(shù)，即可得到工作臺面的染菌量。

2.4無菌工作服染菌量測試

取樣時間  待操作人員實驗結(jié)束后用進行。

接觸碟制備  取無菌平皿，緩緩澆注事先融化（低于40℃）的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基至滿皿（使成凝固后瓊脂表面略高于平皿邊緣）凝固后備用。

測試方法：取備妥的平板2塊，待操作人員實驗結(jié)束后，分別在其工作服的雙臂靠近手腕處，輕輕印壓取樣。培養(yǎng)，計數(shù)。按企業(yè)制定的規(guī)定判定結(jié)果。

3．實驗人員因素 （操作人員雙手染菌量測試、不規(guī)范操作）。

3.1操作人員雙手染菌量測試

取樣時間  實驗人員按常規(guī)程序洗手、消毒，于無菌檢查操作結(jié)束后進行。

供試液制備  取浸有無菌氯化鈉溶液的棉拭子沿著操作人員雙手的指跟朝指尖方向拭抹，

雙手分別拭抹食指到小指各4個指頭，棉拭子剪去手握部分，浸入100ml無菌氯化鈉溶液，

振搖供試液并經(jīng)開放式濾膜法過濾、 取濾膜培養(yǎng)、計數(shù)，即得操作人員雙手的染菌量。

也可取備妥的營養(yǎng)瓊脂平板，待實驗結(jié)束后，操作人員將雙手的五個手指分別在瓊脂表面

涂抹。平板置35℃培養(yǎng)，計數(shù)，即得。

3.2不規(guī)范操作行為

在無菌室的硬件施設(shè)符合規(guī)定的情況下，要注意無菌操作不規(guī)范的行為，主要的有：

3.2.1超大量過濾供試液   有的單位將幾批藥品用一個濾器過濾（200瓶-400瓶），超大量過濾供試液造成的頻繁換瓶，會導(dǎo)致抽入大量空氣，引發(fā)供試液假陽性結(jié)果。就是在正常檢查過程中，也要求關(guān)機換瓶，以防止抽入大量空氣，引發(fā)供試液假陽性結(jié)果。

3.2.2違反操作規(guī)程，在供試品未溶解*的情況下過濾，造成堵膜使培養(yǎng)器杯內(nèi)壓力增加，培養(yǎng)器護帽反復(fù)彈出，破壞空氣濾膜的完整性。

3.2.3抽濾過程中泵速過快  特別在抽濾安瓶裝供試液時，集菌儀的泵速不能超過50轉(zhuǎn)，不然過快的泵速也會導(dǎo)致抽入大量空氣，導(dǎo)致供試品的假陽性結(jié)果。

3.2.4消毒劑的配制與使用管理不規(guī)范引起的供試品假陽性的案例并不少見。

3.2.5要重視藥品外包裝的消毒有效性，因藥品外包裝上污染的微生物可直接被引入到操作過程。

3.2.6培養(yǎng)基多劑量包裝，實驗過程中反復(fù)抽取很有可能造成污染。

3.2.7要注意無菌衣的潔凈度，無菌衣在實施無菌操作前一定要經(jīng)過滅菌處理。

三．供試品出現(xiàn)陽性結(jié)果后的原因追溯方法

樣品無菌檢查出現(xiàn)陽性結(jié)果時，如操作的回顧性追溯及培養(yǎng)器、培養(yǎng)基的陰性對照、實驗環(huán)境的沉降菌等常規(guī)生物監(jiān)控均無發(fā)現(xiàn)原因的，應(yīng)進行污染菌的溯源調(diào)查。過程大致如下：

1.陽性菌種分離、鑒定。

2。相關(guān)因素排查

2.1實驗操作環(huán)境空氣污染微生物

方法：浮懸菌采樣器采取無菌室空氣—空氣樣本中平板菌落形態(tài)與檢出陽性菌比較—取形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽性菌比較---一致的繼續(xù)按陽性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。

2.2消毒液微生物污染

消毒液污染的微生物溯源比較復(fù)雜，污染微生物的來源有消毒劑本地帶入、使用者雙手、配制用水、盛放容器等，一一排查的可操作性不強，下面僅介紹與檢出陽性菌相關(guān)的消毒液排查的方法

方法：

2.2.1菌種分離：陽性檢出發(fā)現(xiàn)時原消毒液尚保留的，可取消毒液100ml，用開放式過濾器過濾后，生理鹽水沖洗300ml，取下濾膜，貼在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，（視檢出的陽性菌性質(zhì)選用培養(yǎng)基），厭氧或需氧培養(yǎng)。有菌落生長的，平板菌落形態(tài)與撿品陽性菌比較—取形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽性菌比較---一致的繼續(xù)按陽性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。

2.2.2陽性檢出發(fā)現(xiàn)時原消毒液已廢棄，可取一定量的陽性菌接種到無菌方法配制的原消毒液中，放置過夜，取一定量，經(jīng)開放式過濾器過濾后，用生理鹽水沖洗300ml，取下濾膜，貼在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，計數(shù)回收微生物。如接種的微生物能回收到75％，那么撿品陽性菌的污染源來自消毒液的可能性較大。

2.3生產(chǎn)環(huán)境排查

2.3.1到生產(chǎn)現(xiàn)場采集空氣微生物，取菌落形態(tài)接近的純化—鏡檢—菌體形態(tài)與陽性菌比較---一致的繼續(xù)按陽性菌的鑒別程序鑒定----結(jié)果判定。

2.3.2陽性檢出菌種與以往生產(chǎn)環(huán)境中收集的微生物比較，判斷。（企業(yè)必須自建菌種庫）