一、背景

人肺動脈內皮細胞是提取于人肺組織的原代細胞系，血管內皮細胞主要作用是維持血管的動態平衡。此細胞能合成和分泌凝血和纖溶系統中的活化和抑制因子，同時也能合成和分泌影響著血小板粘附和聚集的某些介質。內皮細胞還可以釋放具有調控細胞增殖和血管壁張力功能的分子。人肺動脈內皮細胞上的腺苷受體被脂多糖激活后，會引起參與急性肺損傷的病生理過程的IL-6的釋放。許多此類以及其他的作用過程可以應用培養的細胞在體外研究進行研究，人肺動脈內皮細胞正是這類研究中普遍應用的細胞類型。

二、細胞培養步驟

培養基及培養凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

三、細胞處理方法

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

四、應用

用于香煙煙霧提取物經內質網應激CHOP信號通路促進人肺動脈內皮細胞凋亡研究：

明確香煙煙霧提取物是否經內質網應激CHOP信號通路促進人肺動脈內皮細胞凋亡,以及苯基丁酸（PBA）是否具有凋亡抑制作用。

方法：通過慢病毒轉染重組RNA沉默HPAEC人肺動脈內皮細胞CHOP基因表達,將未進行CHOP基因干預的HPAEC人肺動脈內皮細胞及CHOP基因沉默的HPAEC-CHOP人肺動脈內皮細胞各自分為對照組（Ctrl組,常規培養不作特殊處理）、香煙煙霧提取物組（CSE組,培養基中加入10%香煙煙霧提取物）、苯基丁酸組（PBA組,培養基中加入5mmol/L的PBA）和香煙煙霧提取物聯合苯基丁酸組（CSE+PBA組,培養基中加入10%香煙煙霧提取物以及5mmol/L的PBA）,各組細胞分別處理6h、12h、24h,收集后用于后續實驗。通過透射電鏡觀察細胞內質網形態變化,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例,Western-blot檢測CHOP蛋白表達水平,Realtime-PCR檢測CHOP mRNA表達水平。P<0.05認為差異具有統計學意義。

結果：

1、HPAEC-CHOP細胞CHOP蛋白表達水平較HPAEC細胞降低大于80%,說明CHOP基因沉默達到預期效果。

2、透射電鏡觀察內質網形態。Ctrl組以及PBA組HPAEC細胞內質網形態正常,CSE組HPAEC細胞出現內質網腫脹（表現為體積增大和折疊變平變淺）,CSE+PBA組HPAEC細胞內質網腫脹程度較CSE組HPAEC細胞減輕。Ctrl組、PBA組以及CSE+PBA組HPAEC-CHOP細胞內質網形態基本正常;CSE組HPAEC-CHOP細胞內質網無明顯腫脹,但是內質網膜電子密度增高。

3、流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。HPAEC細胞不同處理組相同處理時間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC細胞不同CSE處理時間組比較,處理12h組高于處理6h組,處理24h組高于處理12h組。HPAEC-CHOP細胞不同處理組相同處理時間比較:PBA組凋亡比例與Ctrl組無差異;CSE組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組;CSE+PBA組凋亡比例高于Ctrl組和PBA組,但是低于CSE組。HPAEC-CHOP細胞不同CSE處理時間組比較,凋亡比例無顯著性差異。相同處理時間HPAEC-CHOP細胞與HPAEC細胞比較:HPAEC-CHOP細胞CSE組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE組;HPAEC-CHOP細胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE組;HPAEC-CHOP細胞CSE+PBA組凋亡比例低于HPAEC細胞的CSE+PBA組。

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