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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒的使用細節(jié)

來源:上海貝博生物科技有限公司   2025年07月23日 09:21  
  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒的使用細節(jié)需根據(jù)具體試劑類型和實驗需求進行調(diào)整,以下結(jié)合不同試劑盒的特點及操作要點進行詳細說明:
  一、試劑準備與工作液配制
  1. 染料特性與分裝:
  - 常用探針如E01(藍色熒光,Ex/Em=373/430nm)、ER Green(綠色熒光,Ex/Em=490/520nm)或ER示蹤劑&8482;紅(紅色熒光,Ex/Em=589/620nm),需根據(jù)實驗需求選擇。
  - 染料母液通常為DMSO溶液,需避免反復(fù)凍融。建議使用時分裝為小管,每管一次性使用,長期保存需-20℃避光。
  2. 工作液稀釋:
  - 初始稀釋:用染料稀釋液將母液稀釋10倍,再用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基進一步稀釋50-500倍(貼壁細胞)或20-100倍(需固定/透化的樣本)。
  - 濃度優(yōu)化:最終工作濃度需根據(jù)細胞類型預(yù)實驗確定,原則是“至低有效濃度”,避免背景干擾和細胞毒性。
  二、細胞染色流程
  1. 貼壁細胞染色:
  - 預(yù)處理:棄去培養(yǎng)基,用HBSS緩沖液輕洗細胞1次,移除殘留血清或酚紅(可能干擾熒光)。
  - 孵育:加入預(yù)熱的染色工作液(37℃),覆蓋細胞即可。孵育時間15-40分鐘,需避光操作。
  - 清洗:吸除染液,用新鮮培養(yǎng)基或HBSS洗滌3次,去除游離探針。
  2. 懸浮細胞染色:
  - 重懸染色:離心棄上清,用預(yù)熱的染色工作液重懸細胞,37℃孵育15-40分鐘[。
  - 貼壁輔助:可選多聚賴氨酸處理蓋玻片,使細胞貼附后染色,后續(xù)操作同貼壁細胞。
  三、固定與透化(可選)
  1. 固定:
  - 用含2-4%甲醛的HBSS或培養(yǎng)基固定細胞10分鐘,室溫或37℃均可。固定后熒光信號可能部分衰減,需優(yōu)化固定條件。
  2. 透化:
  - 去污劑法:0.2% Triton X-100的PBS孵育10分鐘,適用于免疫染色(ICC)前處理。
  - 丙酮法:預(yù)冷丙酮透化5分鐘,可降低背景信號,但可能破壞部分膜結(jié)構(gòu)。
  四、觀察與數(shù)據(jù)采集
  1. 濾光片選擇:
  - 根據(jù)探針調(diào)整顯微鏡濾光片,如FITC通道(綠色)、德州紅通道(紅色)或自定義波段。
  2. 活細胞與固定細胞差異:
  - 活細胞染色需快速操作,避免長時間暴露導(dǎo)致探針泄漏;固定細胞可延長觀察時間,但需平衡固定造成的信號損失。
  五、關(guān)鍵注意事項
  1. 操作細節(jié):
  - DMSO母液冬季易凝固,需預(yù)熱至室溫并離心回收液體,吸頭需預(yù)熱防止染料吸附。
  - 避光操作:探針對光敏感,染色及洗滌過程需盡量減少光照。
  2. 兼容性與污染控制:
  - 避免與其他品牌試劑混用,防止交叉污染。
  - 使用一次性耗材,玻璃器皿需清洗并去除殘留清潔劑。
  3. 實驗優(yōu)化:
  - 濃度與時間:不同細胞膜通透性差異大(如腫瘤細胞vs原代細胞),需預(yù)實驗調(diào)整染色條件。
  - 多色染色:可搭配其他熒光標記(如F-actin綠色、細胞核藍色),但需驗證探針光譜重疊性。
  六、常見問題與解決方案
  1. 背景過高:
  - 降低探針濃度或縮短孵育時間。
  - 增加洗滌次數(shù)或改用低吸附耗材。
  2. 染色不均:
  - 確保工作液覆蓋均勻,懸浮細胞需輕柔混勻。
  - 貼壁細胞可延長孵育時間至30分鐘。
  3. 熒光衰減:
  - 固定后信號減弱屬正常現(xiàn)象,可通過延長成像時間或提高激發(fā)強度補償。

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