選擇適合特定實驗需求的 Western 及 IP 裂解液,需要從樣本類型、實驗目的、蛋白質特性等多個維度綜合考量,以確保獲取高質量的實驗結果。
根據樣本類型選擇
細胞樣本:若為普通哺乳動物細胞,常規的 Western 裂解液即可滿足需求,如含 SDS、Tris - HCl、NaCl 等成分的裂解液,能有效裂解細胞并使蛋白質變性,適用于后續 Western Blot 檢測蛋白表達水平 。對于懸浮細胞,需注意裂解液的用量和裂解時間,避免因細胞量少導致蛋白質提取不充分;貼壁細胞則可直接在培養板中加入裂解液裂解,方便快捷。若為原代細胞,因其較為脆弱,宜選用溫和的裂解液,減少對細胞內蛋白質結構的破壞,維持蛋白質的天然狀態,為研究蛋白質功能和相互作用保留更多信息。
組織樣本:由于組織細胞間結構緊密,需選擇裂解能力更強的裂解液。對于軟組織,如肝臟、脾臟等,可使用添加了蛋白酶 K 等消化酶的裂解液,幫助分解細胞間質,促進細胞裂解和蛋白質釋放;對于肌肉、皮膚等纖維成分較多的組織,可能需要配合機械勻漿或超聲破碎等物理方法,同時搭配裂解液,以提高蛋白質提取效率。此外,針對植物組織樣本,因其細胞壁的存在,需選擇含有纖維素酶、果膠酶等成分的裂解液,先破除細胞壁,再裂解細胞提取蛋白質。
依據實驗目的選擇
蛋白質表達分析(Western Blot):主要關注蛋白質的完整提取和充分變性,以便在 SDS - PAGE 電泳中按分子量大小分離。此時,可選用含強離子型表面活性劑(如 SDS)的 Western 裂解液,確保蛋白質變性,同時添加蛋白酶抑制劑,防止蛋白質降解。若研究磷酸化蛋白質,還需加入磷酸酶抑制劑,保持蛋白質的磷酸化修飾狀態,準確檢測磷酸化蛋白的表達水平。
蛋白質相互作用研究(IP):重點在于保持蛋白質的天然構象,使蛋白質間的相互作用得以保留。因此,應選擇溫和的 IP 裂解液,如含 Triton X - 100、NP - 40 等非離子型表面活性劑的裂解液,既能裂解細胞,又能維持蛋白質的空間結構和相互作用位點。此外,為減少非特異性結合,裂解液中可適當降低鹽濃度或添加適量的 BSA 等封閉劑,提高免疫沉淀實驗的特異性。
蛋白質純化:若需從細胞或組織中純化特定蛋白質,需考慮裂解液對目標蛋白質活性和純度的影響。可選擇不影響目標蛋白質活性且能有效去除雜質蛋白的裂解液,同時,根據后續純化方法(如親和層析、離子交換層析等),確保裂解液成分與純化過程兼容,避免對純化步驟產生干擾。
考慮蛋白質特性選擇
蛋白質穩定性:對于不穩定或易降解的蛋白質,如某些轉錄因子、信號蛋白等,需選擇含有高效蛋白酶抑制劑的裂解液,抑制細胞內蛋白酶的活性,防止蛋白質在裂解過程中被降解。同時,在操作過程中盡量保持低溫,減少蛋白質降解的風險。
蛋白質溶解性:若目標蛋白質為膜蛋白或疏水蛋白,普通裂解液可能難以使其充分溶解。此時,可選擇含有較強去垢劑(如 CHAPS、Sarkosyl)的裂解液,增強蛋白質的溶解性;對于親水蛋白,常規裂解液即可滿足需求,但需注意裂解液的離子強度,避免因離子強度過高導致蛋白質沉淀。
蛋白質修飾狀態:當研究蛋白質的磷酸化、糖基化等修飾時,除了添加相應的磷酸酶抑制劑、糖苷酶抑制劑外,還需選擇不會破壞蛋白質修飾結構的裂解液。例如,在研究蛋白質磷酸化時,避免使用會導致蛋白質過度變性的強堿性裂解液,以免破壞磷酸化位點,影響實驗結果的準確性。
其他影響因素
實驗成本:不同品牌和類型的裂解液價格存在差異,在滿足實驗需求的前提下,可綜合考慮成本因素選擇合適的裂解液。對于大規模實驗或預算有限的情況,可選擇性價比高的產品;對于重要的關鍵實驗,可優先考慮質量可靠的品牌裂解液,確保實驗結果的準確性和可靠性。
裂解液兼容性:確保所選裂解液與后續實驗中使用的試劑、儀器等兼容。例如,若后續需進行質譜分析,裂解液中的成分不能干擾質譜檢測;若使用特定的抗體進行免疫檢測,裂解液不能影響抗體與抗原的結合活性。在進行新的實驗或使用新的裂解液時,建議先進行小規模預實驗,驗證裂解液的適用性和兼容性。