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一、技術原理與優勢
在生物偶聯領域，借助水溶性的 1 – 乙基 – 3-[3 – 二甲基氨基丙基] 碳二亞胺（EDC）對羧基進行活化，能夠促使蛋白質與羧基化微球表面通過共價鍵結合。此反應會生成活性中間體 ，該中間體可與伯胺（作為親核試劑）迅速反應，進而形成穩定的酰胺鍵。不過，EDC 反應生成的活性中間體穩定性欠佳，容易被水水解，水解后會再生羧基。為解決這一問題，在反應中引入 N – 羥基磺基琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS），它能與活性中間體作用，形成更為穩定的 Sulfo-NHS 酯中間體。該中間體與伯胺反應速度雖慢，但最終能生成穩定的酰胺鍵。
兩步法共價偶聯方案具有顯著優勢，尤其適用于同時含有羧基和伯胺基團的分子（如蛋白質）的偶聯。由于能形成更穩定的 Sulfo-NHS 酯中間體，所以在添加蛋白質之前可去除過量的 EDC，這樣就能避免蛋白質上羧基被活化，降低蛋白質交聯的可能性。此外，該方法還便于進行緩沖液交換，有助于提高偶聯產率。此方案既適用于高密度（COOH>100μeq/g）的羧基改性微球，也適用于低密度（COOH<100μeq/g）的羧基改性微球。
二、關鍵操作要點與注意事項
（一）試劑與微球預處理
試劑儲存與配制
EDC 需儲存于 – 20°C 的干燥容器中，使用前要使其平衡至室溫。EDC 對水分極為敏感，若出現潮濕或結塊現象，則不可使用，且 EDC 溶液需現用現配。
Sulfo-NHS 溶液同樣要現用現配。
所有試劑在使用前都應平衡至室溫。
微球重懸與分散
2μm 微球：28,500×g，離心 9 分鐘。
3μm 微球：19,300×g，離心 7 分鐘。
4μm 微球：14,200×g，離心 7 分鐘。
5μm 微球：14,200×g，離心 5 分鐘。
為使微球重懸更順利，應盡量讓微球顆粒保持松散狀態。不同尺寸微球對應的離心力與時長如下：
在洗滌步驟之間，務必將微球保持重懸，特別是在配體偶聯之前。可先用移液器吸頭反復吹打微球沉淀物，打碎大塊團聚物，必要時進行超聲分散。
浸入式超聲波探頭是將微球重新懸浮至單分散狀態的有效方式，而吸頭吹打、渦旋混合和水浴超聲通常效果不夠理想。
超聲處理時要避免樣品過熱，若有需要，可將試管浸入冰水中進行超聲。
從外觀上看，正常的微球溶液應呈略帶 “乳白色”，這表明微球聚合情況良好。還可在 400 倍放大倍數下評估微球團聚程度，單分散微球在該倍數下難以看到，只能看到朦朧的微球 “海”，而團聚的微球則很容易觀察到。
制備緩沖液和洗滌微球時，需使用 Milli-Q® 純水，以防止污染物影響實驗。
抗體濃度需根據特定測試要求進行優化。對于昂貴的抗體，若數量難以達到較好的摩爾比，可添加非特異性蛋白質（如牛丙種球蛋白或 BSA）來占據剩余反應位點。
（二）緩沖液選擇
在 pH4.5 至 7.2 之間，使用 EDC 和 Sulfo-NHS 進行活化效果較好。因此，通常優先選用 pH 為 6 的 MES（2-(N – 嗎啉代) 乙磺酸）緩沖液進行活化反應。需要注意的是，活化緩沖液中不應含有伯胺或羧基，因為它們會與活化反應競爭，磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液也會降低 EDC 的反應性。MES 可用作偶聯緩沖液，若需進一步優化條件，也可選用其他不同 pH 的緩沖液。
三、兩步法偶聯實驗方案
（一）實驗材料與設備
微球：羧基聚苯乙烯微球。
緩沖液
活化 / 偶聯緩沖液：50mM MES，0。
封閉緩沖液：50mM Tris，0，0.5%（w/v）酪蛋白。
試劑：EDC、Sulfo-NHS、乙醇胺。
設備：Eppendorf – 5430 離心機（帶 FA – 45 – 24HS 轉子）、Hielscher Ultrasonics – UP50H 緊湊型實驗室均質機。
（二）操作步驟
微球洗滌和活化
將 100μL 微球（10% w/v 固含量）分裝到低蛋白結合的 Eppendorf 管中，加入 1mL 活化 / 偶聯緩沖液并充分混合。需注意，活化 / 偶聯緩沖液的組分不應含有游離羧基、伯胺基或巰基，以免干擾偶聯反應。
按照合適的離心條件對微球進行離心（具體離心條件如前所述），倒出上清液，重復洗滌步驟兩次。洗滌過程中，要確保微球在步驟之間保持重懸，必要時可使用超聲探頭分散，還可在顯微鏡下檢查微球分散情況。
最終洗滌后，將微球重懸于 1mL 活化 / 偶聯緩沖液中，確保微球分散良好。
使用前立即準備活化試劑，制備 200mM EDC 溶液和 200mM Sulfo-NHS 溶液。
向 1mL 洗滌過的微球中快速加入 24μL 200mM EDC 溶液和 240μL 200mM Sulfo-NHS 溶液，在室溫下渦旋混合并在轉盤上孵育 30 分鐘。
孵育結束后離心沉淀微球，倒出上清液，用 1mL 活化 / 偶聯緩沖液洗滌微球并充分混合，再次離心沉淀微球，重復洗滌步驟兩次。
將微球重懸于 700μL 活化 / 偶聯緩沖液中，在添加抗體 / 配體前，需確保微球分散良好，必要時進行超聲分散。
抗體偶聯
用活化 / 偶聯緩沖液制備濃度為 2mg/mL 的抗體溶液。
根據每克微球 60mg 抗體的包被濃度，在 700μL 微球中加入 300μL 抗體（2mg/mL），混完成，此時總液體體積為 1mL。
在室溫下于旋轉混合器上將上述懸液混合5 小時。
對于 1mL 1% 的微球，添加 30μL 乙醇胺（在通風櫥中操作），渦旋并在旋轉混合器上混合 30 分鐘以封閉微球。
按照正確的離心速度旋轉試管沉淀微球，倒出上清液（可選：保留上清液用于 BCA 分析蛋白質含量）。
將微球重懸于 1mL 封閉緩沖液中，在室溫下，在轉盤上超聲處理并混合至少 2 小時，也可在室溫下攪拌過夜。
再次離心沉淀微球，倒出上清液，添加 1mL 封閉緩沖液，必要時通過吸頭吹打和超聲處理重懸微球，重復離心和洗滌步驟兩次。
最終洗滌步驟后，除去上清液，加入 1mL 封閉緩沖液，此時微球含量為 1% w/v，通過吸頭吹打和超聲處理重懸微球（可選：在顯微鏡下檢查微球分散情況），將懸浮液儲存在 4°C 下，建議在 5 天內使用，偶聯產物的儲存穩定性需單獨評估。
四、常見問題與解決方案
| 問題現象 | 可能原因 | 解決措施 |
|---|---|---|
| 使用前微球聚集 | 儲存或操作過程中微球發生團聚 | 使用前渦旋并超聲分散微球 |
| 結合過程中或結合后的微球聚集 | EDC 加入方式不當、蛋白量不足、離心或洗滌操作問題 | 緩慢添加 EDC，加入后充分混合微球，降低微球濃度至 0.5%；增加蛋白濃度，嘗試其他偶聯緩沖液，對樣品進行超聲處理打散團聚體；注意充分重懸沉淀，降低離心速度或時間，更劇烈吹打沉淀，增加超聲處理時間和 / 或強度，減少微球用量；添加少量表面活性劑（如 0.025% SDS） |
| 抗體或配基與微球的結合量低 | EDC 失活、Sulfo-NHS 中間體水解、蛋白量不足等 | 使用新鮮的 EDC，使用前立即準備 EDC 和 Sulfo-NHS，增加包被濃度，羧基活化后立即加入蛋白，避免加入帶有競爭性基團的蛋白或其他組分，更改偶聯緩沖液種類和 / 或 pH |
| 包被重復性不好 | 操作過程中混合不充分或試劑不新鮮 | 在每個步驟中將微球懸浮液充分混合，使用新鮮試劑 |
| 偶聯抗體后的微球非特異性吸附高 | 封閉劑選擇不當、封閉反應時間不足等 | 使用替代封閉劑（BSA、甘氨酸、酪蛋白、魚皮明膠），增加封閉反應時間，在淬滅步驟中減少乙醇胺的量，減少包被蛋白的量，嘗試使用具有較高羧基電荷密度的微球，解決微球團聚問題（參考解決方案 2） |
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