在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，貼壁生長是許多細(xì)胞類型（尤其是哺乳動物細(xì)胞）的基本特性。以下是培養(yǎng)細(xì)胞時細(xì)胞貼壁的關(guān)鍵點(diǎn)：

1. 培養(yǎng)基選擇：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的培養(yǎng)基，例如人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT 116需要5A全培養(yǎng)基，而SW 620則需要DMEM全培養(yǎng)基。全培養(yǎng)基通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清（如FBS）、雙抗（青霉素鏈霉素）按特定比例配制。

2. 換液：當(dāng)細(xì)胞未達(dá)到約80%匯合度時，可以僅換液而不傳代。快速生長的細(xì)胞如HCT 116和SW 620，適合一天一換液，兩天一傳代，但具體頻率應(yīng)根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整。

3. 傳代步驟：

1) 消化：使用胰酶（0.25% TrypsinEDTA）消化，注意消化時間，避免過長導(dǎo)致細(xì)胞損傷，通常510分鐘。

2) 終止消化：加入全培養(yǎng)基終止消化，并用移液槍輕柔吹打使細(xì)胞分散。

3) 離心（可選）：離心后吸去上清，加入適量培養(yǎng)基重懸，根據(jù)需要進(jìn)行分瓶。

4. 細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)胞貼壁生長時，應(yīng)保持在對數(shù)生長期，避免達(dá)到匯合度100%導(dǎo)致接觸抑制，影響細(xì)胞增殖。

5. 凍存：細(xì)胞凍存需使用凍存液（90%全培養(yǎng)基 + 10% DMSO），遵循慢凍原則，從4℃逐漸降至80℃，最終移至液氮保存。

6. 注意事項(xiàng)：

1) 無菌操作至關(guān)重要，防止污染。

2) 調(diào)整胰酶濃度和消化時間以適應(yīng)不同細(xì)胞類型。

3) 細(xì)胞密度適中，避免過密導(dǎo)致傳代后漂浮。

4) 保持培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度和溫度穩(wěn)定，確保pH值適宜。

5) 定期檢查細(xì)胞活力和形態(tài)，及時處理問題。

通過以上步驟和注意事項(xiàng)，可以有效維持貼壁細(xì)胞的健康生長和傳代。

培養(yǎng)細(xì)胞時避免細(xì)胞貼壁不佳，可以通過以下方法：

1. 胰蛋白酶消化恰當(dāng)：胰蛋白酶用于使細(xì)胞從培養(yǎng)表面脫落，但消化時間過長或濃度過高會損傷細(xì)胞膜。應(yīng)每隔一分鐘觀察并輕輕晃動培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞大部分脫落時立即添加培養(yǎng)基終止消化。對于難消化的細(xì)胞，可以采用“四步消化法”，即先不加胰酶清洗，再用少量培養(yǎng)基吹打，然后分批加入胰酶消化，每次觀察細(xì)胞狀態(tài)，避免過度消化。

2. 輕柔操作：在細(xì)胞傳代或接種過程中，避免劇烈震蕩或吸吐，減少機(jī)械損傷。操作時應(yīng)輕拿輕放，尤其是對脆弱的細(xì)胞株。

3. 控制接種密度：過高的細(xì)胞密度會導(dǎo)致競爭營養(yǎng)和空間，過低則缺乏必要的細(xì)胞間相互作用。根據(jù)細(xì)胞類型，通常保持在7080%匯合度進(jìn)行傳代，以維持最佳生長狀態(tài)。

4. 檢測和預(yù)防污染：支原體和其他微生物污染會影響細(xì)胞貼壁。使用無菌試劑，定期檢測培養(yǎng)基和細(xì)胞庫，一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時清理并丟棄受污染的細(xì)胞。

5. 調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境：確保培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和CO2濃度適宜，避免pH值異常，因?yàn)椴磺‘?dāng)?shù)腃O2濃度會影響培養(yǎng)基pH值，進(jìn)而影響細(xì)胞貼壁。

6. 了解細(xì)胞特性：不同細(xì)胞株的貼壁特性不同，有的需要特定的附著基質(zhì)。查閱細(xì)胞系的使用說明，了解其生長特性和傳代方式。

7. 避免老化細(xì)胞：細(xì)胞老化會影響其貼壁能力，及時傳代，控制細(xì)胞代數(shù)，避免長期培養(yǎng)導(dǎo)致的細(xì)胞衰老。

8. 調(diào)整培養(yǎng)基成分：某些細(xì)胞可能對特定成分敏感，如pH值過高，可使用無菌醋酸溶液調(diào)整，或調(diào)整培養(yǎng)基中的NaHCO3濃度。

9. 使用適宜的培養(yǎng)基和血清：根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的全培養(yǎng)基和血清，確保營養(yǎng)供應(yīng)平衡。

10. 觀察與記錄：每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄培養(yǎng)條件，及時調(diào)整培養(yǎng)策略，如細(xì)胞狀態(tài)變差，可能需要更換培養(yǎng)基或調(diào)整傳代頻率。

通過上述措施，可以有效避免細(xì)胞貼壁不佳的問題，確保細(xì)胞培養(yǎng)的順利進(jìn)行。