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載玻片是生物學、醫學及材料科學實驗中常用的工具之一，其使用規范直接影響樣本制備質量、觀察效果及實驗結果的準確性。以下從載玻片的選擇、清潔、樣本處理、封片技術、染色與固定、標記與保存等環節，系統闡述其使用細節及注意事項。
一、載玻片的選擇與預處理
1. 材質與類型
- 普通載玻片：用于常規組織、細胞或微生物觀察，厚度通常為1-1.2mm，需滿足透光性要求。
- 磨砂邊載玻片：邊緣磨砂處理，便于書寫標記，避免滑脫。
- 帶凹槽載玻片：用于液體樣本(如血液、細菌懸液)，可防止樣本流動。
- 熒光專用載玻片：低熒光背景，適用于熒光顯微觀察。
2. 清潔與滅菌
- 新載玻片處理：出廠時可能殘留油脂或灰塵，需用70%乙醇擦拭，再以超純水沖洗，烘箱干燥(60℃, 30分鐘)。
- 重復使用載玻片：先用洗衣粉水煮沸去除蛋白殘留，清水沖洗后浸泡于鉻酸洗液(需戴防護手套)過夜，取出后流水沖洗12小時，烘干備用。
- 滅菌處理：高溫高壓滅菌(121℃, 20分鐘)或紫外線照射30分鐘，避免微生物污染。
二、樣本加載與固定
1. 樣本類型與加載方式
- 液體樣本(如血液、細菌懸液)：
- 滴加少量樣本(直徑約5mm)于載玻片中央，避免過量導致溢出。
- 血液樣本需推片制備血涂片：取一滴血置于一端，以另一載玻片邊緣快速推平，形成均勻薄層。
- 固體樣本(如組織切片、菌落)：
- 用鑷子夾取樣本，輕放于載玻片中央，最小化機械損傷。
- 培養細胞：
- 棄去培養基，用PBS輕洗后，胰酶消化收集細胞，滴加懸浮液并自然沉降。
2. 固定方法
- 空氣干燥法：適用于血液、糞便樣本，室溫靜置至干燥。
- 化學固定法：常用甲醇、乙醇或丙酮固定5-10分鐘，用于細胞形態固定。
- 加熱固定法：火焰灼燒載玻片背面(需遠離樣本)，快速通過以固定細菌涂片。
三、封片技術與蓋玻片使用
1. 封片劑選擇
- 水溶性封片劑：甘油、PBS(用于活細胞觀察)。
- 非水溶性封片劑：中性樹膠(如DPX)、指甲油(用于封片)。
- 熒光封片劑：抗熒光淬滅劑(如ProLong Gold)。
2. 蓋玻片操作規范
- 傾斜接觸法：以45°角緩慢放下蓋玻片，避免產生氣泡。
- 封片劑用量：液體樣本需覆蓋樣本且不超過蓋玻片1/3面積；過量會導致溢出或樣本漂移。
- 排除氣泡：輕壓蓋玻片邊緣，用濾紙吸除多余液體，或用鑷子輕敲載玻片排出氣泡。
四、染色與標記
1. 染色步驟
- 單一染色法(如亞甲藍、結晶紫)：滴加染液覆蓋樣本，染色30秒-2分鐘，水洗后吸干。
- 復合染色法(如革蘭氏染色)：需嚴格按順序操作(初染→媒染→脫色→復染)，脫色時間控制精準。
- 免疫熒光染色：樣本需封閉(如BSA孵育)，一抗、二抗依次孵育，避光操作。
2. 標記與記錄
- 標記位置：用記號筆在磨砂面標注樣本名稱、濃度、日期，避免接觸樣本面。
- 編號規則：采用“日期+樣本類型+編號”格式(如20231001-Blood-01)。
五、保存與常見問題
1. 保存條件
- 短期保存：封片后置于干燥盒內，避光防潮。
- 長期保存：用封口膜包裹載玻片，存放于切片盒中，4℃或-20℃保存。
2. 常見問題與解決
- 氣泡殘留：重新封片或用針頭挑破氣泡后補封片劑。
- 樣本過厚：可能導致顯微鏡調焦困難，需重新制備更薄樣本。
- 污染霉變：樣本發霉時用70%乙醇擦拭，重新固定封片。
- 蓋玻片碎裂：操作時避免用力不均，選用合適厚度的蓋玻片(通常18μm)。
六、特殊實驗注意事項
1. 活細胞觀察：需使用恒溫載物臺(37℃)，封片劑選擇生理鹽水或專用培養基。
2. 原位雜交(FISH)：載玻片需經多聚賴氨酸處理以增強樣本附著力。
3. 電子顯微鏡樣本：需將樣本包埋于樹脂中，載玻片僅用于初步處理。
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