在納米顆粒表征領域，粒徑、濃度與電位等參數的精準測定是確保研究和應用成功的核心要素。前期文章我們曾詳細分享過「納米顆粒檢測中的常見參數」。精確獲取這些參數，不僅有助于深入解析納米材料的物理化學特性，還為其在生物醫藥、材料科學、環境科學等領域的實際應用提供了關鍵依據。然而，測量數據的準確性、可靠性、重復性與再現性僅依靠先進的儀器設備本身是不夠的，還需要通過一套嚴格的驗證流程來保障儀器的性能和操作的規范。這便是3Q認證 (IQ、OQ、PQ) 在納米顆粒表征中的重要性所在。

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3Q認證的內容及意義

在納米顆粒表征領域，3Q認證不僅規范了儀器的安裝與運行，還通過系統化驗證流程確保數據的科學性和可重復性。本文將詳細解讀3Q認證的核心內容及其在納米顆粒表征中的具體實施內容，探討如何通過嚴格的驗證體系提升儀器的可靠性，助力納米科學及產業應用的高質量發展。

• 文件審核：檢查儀器的安裝手冊、用戶手冊、維護手冊等文件是否齊全。核對儀器的名稱、型號、序列號等基本信息，確保與采購清單一致。確認儀器的安裝環境是否符合設計要求，包括溫度、濕度、電源等。
• 安裝環境確認：確保安裝地點的環境條件（如排風、溫濕度控制、電力供應等）符合儀器的運行要求。檢查儀器的電氣安全、機械安全和環境安全是否符合相關標準。
• 儀器部件確認：核對儀器的各個部件是否安裝正確，連接是否牢固。確認儀器的校準和調試是否完成，所有功能是否正常。

納米顆粒檢測設備屬于精密的測量儀器，測試數據關乎后續的一系列科研生產工作。通過嚴謹的PQ認證，基本可確定儀器的檢測能力，對日后如何正確看待該儀器的測試數據有重要的指導意義。對于精密的表征儀器，PQ認證又包括哪幾方面的實驗驗證內容呢？接下來，我們將深入探討PQ認證中的各項關鍵實驗及其對數據質量的影響。

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有關PQ驗證的關鍵參數

根據 ICH Q2(R2) ，精密度又可分為以下三類：

• 重復性 (Repeatability) ：在相同實驗室、相同操作員、相同儀器、相同條件下進行的短時間內重復測量所得結果的精密度。以顆粒濃度檢測為例，建議 (a) 設置至少9次測試，即3個不同濃度，每個濃度重復3次；或者 (b) 對某一固定測試濃度至少重復測試6次來評估重復性。
• 中間精密度 (Intermediate Precision)：在同一實驗室，但不同操作員、不同時間或不同儀器條件下進行的測量所得的精密度。具體的驗證實驗范圍，需要驗證者根據實際應用場景確定。換句話說，不是所有情況下都需要逐一單獨測試每個變量，也不一定要全面測試所有變量，而是要根據實際需求，評估可能影響測量精密度的隨機因素，并根據生產開發和風險評估進行驗證實驗設計。根據不同評估因素和實驗設計，中間精密度又包括日間精密度（不同的測試日期），室間精密度（不同的環境條件：溫濕度變化、振動、氣流等），人員精密度（不同操作者），設備間精密度（不同儀器或不同批次的儀器），批間/批內精密度（批次間或同一批次內的樣本）等。
• 再現性 (Reproducibility)：在不同實驗室或不同環境下，由不同人員使用相同的方法測量所得結果的精密度。在大多數情況下，監管機構（如 FDA、EMA）通常不會強制要求提交再現性測試的數據，但在以下情況下，還是需要考慮進行這類測試：(a) 標準化分析方法（如要把某個檢測方法納入藥典）。 (b) 多個實驗室共同使用（如跨地區或跨機構的實驗室都要使用相同的方法時）。

變異系數 (Coefficient of Variation, CV) 是衡量數據離散程度的一個統計指標，表示為數據的標準差相對于平均值的比例（因此有時也稱為相對標準差，RSD），可以直觀地比較不同儀器或不同測量條件下的穩定性。它是一個無量綱的指標，通常以百分比表示。CV值越小，離散程度低越，說明測量結果的重復性和穩定性越好，精密度越高。變異系數的計算公式為：

• LOD：分析方法或儀器能夠可靠檢測到目標物存在的量值（粒徑、濃度、電位等）但不要求該信號能被準確量化。LOD 代表了檢測方法的靈敏度下限，同時對痕量分析至關重要。

• LOQ：可以定量測量分析物的檢測范圍下限。分析方法或儀器能夠可靠且準確測量目標物的量值（粒徑、濃度、電位等），要求測量值具有足夠的準確度和精密度。LOQ 設定時，需要滿足CV% ≤ 10%（或更嚴格要求）。

線性 (Linearity) 指的是分析方法在特定濃度范圍內，檢測信號（響應值）與被測物質的濃度或數量之間呈現線性關系的能力。簡言之，當樣品濃度或粒子數量在一定范圍內變化時，測量結果應當成比例地變化。線性良好的方法具有較高的線性相關系數 (Correlation Coefficient, R²)，R²越接近1，線性關系越好。通常一組數據的R²≥ 0.8才被認為具有相關性；而要保證數據的可靠性，往往要求 R²≥ 0.99（或參考具體行業標準）。

線性區間（Linearity Range或Linear Region） 是指在特定濃度或粒子數量范圍內，檢測方法保持線性關系的最大范圍。低于線性區間下限，信號可能低于儀器LOD，無法可靠檢測；高于線性區間上限，則可能出現信號飽和，儀器無法正確響應或者出現非線性效應。在PQ過程中，也需要驗證分析方法或儀器的線性區間，通常采用以下實驗方法：

• 標準曲線法 (Calibration Curve Method)：使用不同濃度或不同粒子數量的標準樣品進行測量，繪制標準曲線。具體實驗步驟如下：

1. 準備一系列不同濃度的標準樣本，可以是有理論標稱濃度的標準微球或已知濃度的其他實際樣本。不同的濃度設置通常采用對初始樣本進行連續或倍比稀釋來制備。（ICH建議在整個范圍內至少適當分布5個濃度 ^[2] 。）

2. 使用待測方法分別對每個樣品進行測量，記錄檢測信號（如吸光度、熒光強度、峰面積等）或量值（直接的濃度賦值等）。

3. 繪制檢測信號/量值 (y) 與預期濃度 (x) 的散點圖。

4. 通過線性回歸分析擬合直線，計算斜率 (k) 、截距 (b) 和相關系數 (R²) 。

5. 根據R²和回收率驗證標準（通常要求偏差在±10%以內）確定線性區間。

• 線性回歸法 (Linear Regression Method)：若待測樣本的濃度未知，則以該樣本原液濃度為最高濃度，用相同的緩沖液體系連續稀釋（或從原液倍比稀釋）4-5個濃度梯度，實施上述標準曲線法。區別在于將預期濃度調整為各濃度梯度樣本稀釋倍數的倒數 (1/N Dilution factor)。繪制濃度測量值（或梯度各點的濃度均值）與對應稀釋比之間的線性回歸擬合直線，并評估R²（如下圖）。此方法為分析驗證中較常采用的方法之一。

混合NIST標準微球樣本的濃度線性

• 加標回收率法 (Spiked Recovery Method)：類似于準確度驗證中的加標實驗，分析步驟如下：

1. 在空白基質中加入已知濃度的目標分析物，制備一系列加標樣品。

2. 使用待測方法對加標樣品進行測量，記錄檢測信號或直接量值，計算回收率。

3. 根據回收率（通常要求80%-120%）和線性回歸分析結果確定線性區間 ^[6]。

值得注意的是，線性區間與檢測范圍有一定區別：

專屬性即分析方法在測定目標物時，是否能避免其他物質的干擾，從而準確地識別或定量目標物。專屬性驗證往往是分析方法驗證中需要首先考慮的驗證內容之一，它關乎是否選擇了適用的檢測方法。納米顆粒表征穩健性驗證常常采用加標實驗的方法來進行干擾測試：

1. 在待測樣本基質中摻入一定量當前方法不敏感的樣本或雜質，如不適用該檢測方法的樣本或在檢測范圍以外的干擾樣本。通過比較加入干擾樣本前后的數據變化，檢驗該摻入是否影響檢測結果。例如，某設備檢測量程為50-200 nm，在待測樣本中加入已知粒徑較小 (20-30 nm) 的標準微球或蛋白質顆粒溶液，分別檢測含有添加物的樣本和不含添加物樣本的粒徑和濃度，從而判斷該設備是否適用于此類樣本的表征。

2. 在待測樣本中加入已知量的內標，測量待測樣本的同時，評估設備對標準物質的檢測響應是否符合理論預期，驗證不同尺寸顆粒混合后的分布測量是否準確。例如，在外泌體 (exosomes) 樣本（通常粒徑范圍在30-150 nm）中加入等量（相同顆粒濃度）粒徑150 nm的CRM微球內標，檢測加入內標后樣本的粒徑和濃度與加標前的變化。若可以檢測到相應的內標信號，同時加標后混合物的平均粒徑值與理論粒徑均值相符（回收率在接受范圍內），濃度值不變，則可判斷該檢測方法對該外泌體樣本的具有專屬性。該實驗特別適用于評估儀器對多分散體系 (polydisperse system) 樣本的檢測能力。

穩健性（也稱耐用性）是指分析方法在小范圍實驗條件變化（如溫度、pH、試劑濃度等）下，仍能維持測定結果的穩定性和可靠性。它衡量方法對輕微環境波動的耐受能力。此外，穩健性測試還可以用于評估樣品制備和試劑的穩定性，確保在整個實驗過程中數據不會因這些因素的變化而受影響。通俗地說，就是提前評估檢測方法的“抗干擾能力”，確保它在現實實驗條件下（非理想條件下）也能正常工作。穩健性測試的結果可以在方法開發階段作為參考數據提交，或者在監管機構要求時提供。

03

結語

參考文獻：

1.國家市場監督管理總局. (2020). 《藥品生產質量管理規范（GMP）》.

2.International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). (2023). Validation of Analytical Procedures Q2(R2).

3.U.S. Food and Drug Administration (FDA). (2011). Process Validation: General Principles and Practices.

4.International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH). ICH Q7: Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients[S]. 2016.

5.USP General Chapter <1058>: Analytical Instrument Qualification[S]. United States Pharmacopeia, 2023.

6.U.S. Food and Drug Administration (FDA). Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry[S]. 2018.

7.《中國藥典2020版》——9101分析方法驗證指導原則