超微量核酸定量分析儀(如超微量核酸蛋白測定儀)對蛋白的測試主要基于紫外-可見分光光度法,通過測量蛋白質在特定波長(如280nm)的吸光度來估算其濃度。以下是其測試蛋白的具體方法及關鍵步驟:
一、測試原理
蛋白質分子中的色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)殘基以及Cys-Cys二硫鍵在280nm波長處有顯著吸收。儀器通過測量蛋白質溶液在280nm處的吸光度(A280),結合朗伯-比爾定律,直接計算蛋白質濃度(mg/ml)。此方法無需構建標準曲線,但需確保樣品中不含其他在280nm處有強吸收的雜質(如核酸、酚類物質)。
二、操作步驟
儀器準備
連接電源,啟動儀器,預熱5-10分鐘至穩定狀態。
選擇“蛋白A280”檢測模式,并設置光程(通常為10mm,但儀器可能自動調整)。
使用高純度蒸餾水或空白緩沖液進行零點校準,消除背景干擾。
樣品處理
樣品量:建議使用2μL樣品(部分儀器支持0.5-2μL微量檢測),確保形成穩定液柱。
避免氣泡:點樣時輕觸檢測孔底部,緩慢釋放液體,防止氣泡影響吸光度測量。
表面張力:若樣品表面張力低(如含去污劑),可增加樣品量至4μL以保證液柱穩定性。
空白對照
取2μL空白溶液(如緩沖液)加至下基座,放下上基座并點擊“空白”按鈕,記錄背景吸光度。
擦拭基座,確保無殘留液體。
樣品檢測
取2μL待測樣品加至下基座,放下上基座并點擊“樣品”按鈕。
儀器自動測量吸光度并計算濃度,結果通常以mg/ml為單位顯示。
高濃度樣品:若吸光值超過儀器量程(如光強<200),需稀釋樣品后重新檢測。
數據記錄與清理
保存檢測結果,并導出為CSV或PDF格式。
用無塵布擦拭基座,避免交叉污染。
三、關鍵注意事項
基線校準
默認基線校準波長為340nm,用戶可根據需要調整。
必須在樣品檢測前完成校準,否則光譜值將偏移,導致濃度計算錯誤。
樣品純度
避免樣品中含核酸、酚類或高濃度鹽離子,這些物質可能在280nm處產生干擾吸收。
若需檢測含雜質樣品,可結合比色法(如BCA、Bradford法)或使用雙波長(280nm/340nm)扣除背景。
儀器維護
光源:避免長時間曝光,不使用時關閉光源以延長壽命。
單色器:定期更換干燥劑(如硅膠),防止色散元件受潮生霉。
檢測器:防止強光直射或受潮積塵,保持清潔。
環境:儀器應放置在干燥、穩定的工作臺上,遠離空調出風口或直射陽光,溫度控制在25℃±2℃。
特殊樣品處理
冷凝樣品:采用45度斜面貼壁緩慢加載,防止溢出或牛頓環干擾。
多糖類物質:檢測后需用乙醇試劑沖洗液路,避免殘留。
油脂樣品:若發生上浮現象,需先低溫離心分離后再檢測。
四、應用場景與優勢
快速定量:無需復雜前處理,2-5分鐘內完成檢測,適合高通量篩選。
微量檢測:僅需0.5-2μL樣品,節省珍貴樣本(如臨床標本、稀有蛋白)。
多參數分析:部分儀器支持同時檢測A260(核酸)、A280(蛋白)及OD600(細菌濃度),實現多組分定量。
便攜性:緊湊設計,適用于現場檢測或移動實驗室。
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