收到細胞后,首先觀察瓶身是否完好(注意有無縫隙,裂痕);顯微鏡下觀察細胞的生長狀況,有無細胞漂浮;用新潔爾滅消毒瓶口及瓶身;打開瓶口,再次用新潔爾滅消毒瓶口(可能會有液體溢出,注意不要碰到液體),酒精燈烤瓶口消毒;將培養液轉移至50ml離心管或廣口瓶中(若細胞漂浮嚴重,離心培養基,1000g*5分鐘,將離心后的培養基轉移至另一個大離心管中,留一點吹打細胞沉淀成懸液,回收細胞至原培養瓶),若漂浮不嚴重,亦離心一下;在原培養瓶中留一部分原裝培養液,再補加自己新配的培養基至適當容積,例如4ml,讓細胞適應一下環境。 當細胞長到70-80%,凍存大部分,小部分傳代。
關鍵操作規范:
復蘇流程:
快速解凍:37℃水浴中搖晃凍存管,5-10分鐘內完成,加入4-6mL培養基離心去除DMSO37。
初始接種:細胞懸液置于T25瓶或6cm皿,24小時內貼壁伸展,48小時換液。
日常維護:
換液頻率:每周2-3次,pH值穩定在7.0-7.4。
污染防控:嚴格無菌操作,定期檢測支原體,使用雙抗預防細菌污染。
異常處理:
貼壁失敗:復蘇24小時未貼壁的細胞存活率下降30%-50%,需棄用。
消化成團:吹打力度需輕柔均勻,避免機械損傷。
注意事項:
1)細胞漂浮:培養瓶不開封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培養箱。次日觀察,如細胞大部分又貼回瓶底,表明細胞活力正常,剩余漂浮的細胞可以離心去掉,留10ml培養液培養觀察,細胞生長至匯合度80%,進行消化傳代;如細胞還是不貼壁,將細胞離心收集轉到新培養瓶,原培養瓶加部分培養液繼續培養,中間注意觀察,我們的技術人員會一直跟蹤指導,直到問題解決。
2)對于生長緩慢的貼壁細胞:可采用適當的提高培養基中血清濃度,或隔日換液的方法來保證細胞的狀態和生長速度。
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