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DNA聚合酶是什么?DNA聚合酶的作用及特性詳解!-賽默飛

來源:賽默飛世爾科技(中國)有限公司   2025年07月10日 09:56  


DNA聚合酶在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色,是PCR反應(yīng)的組成部分。因此,充分了解聚合酶的特點(diǎn)以及高級DNA酶今后的發(fā)展方向,對于將PCR方法推廣到各種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要。自從在早期PCR實(shí)驗(yàn)中開始使用 賽默飛Taq DNA DNA聚合酶至今,其特異性、熱穩(wěn)定性、保真度和合成能力得到了明顯的改進(jìn)。以下就為您介紹這些改進(jìn)型DNA酶的特點(diǎn),以及它們與提高PCR實(shí)驗(yàn)效果的密切關(guān)系。

 

 

本頁內(nèi)容

特異性

熱穩(wěn)定性

保真度

合成能力

 

特異性

非特異性擴(kuò)增是PCR反應(yīng)最主要的障礙之一,因?yàn)樗鼤@著降低目的基因擴(kuò)增的產(chǎn)率和靈敏度,從而影響擴(kuò)增結(jié)果的合理解釋和下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的成功。而DNA聚合酶經(jīng)常會延伸錯(cuò)配的目的基因和引物二聚體,這是非特異性擴(kuò)增的常見來源。如何減少非特異性擴(kuò)增?方案之一是在冰上配制PCR反應(yīng)。這樣有助于將DNA聚合酶的活性保持在低水平,但在PCR開始之前依然可能會合成不需要的產(chǎn)物。另一個(gè)辦法是將DNA聚合酶的加入時(shí)間推遲到第一個(gè)循環(huán)的退火步驟。因?yàn)橹挥性?0℃以上的初始變性步驟之后才能開始擴(kuò)增,所以該技術(shù)被稱為“熱啟動”。

 

盡管手動熱啟動程序能夠有效改善特異性,但是其過程不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且會增加樣品污染和降低可重復(fù)性的風(fēng)險(xiǎn)。1994年,具有真正熱啟動特性的TaqDNA聚合酶問世[1,2],通過在室溫下配制反應(yīng)時(shí)將特異性抗體與聚合酶結(jié)合來抑制其活性。在初始高溫變性步驟(如,>90℃)階段,結(jié)合的抗體失活,從而激活DNA聚合酶(圖1)。

圖片1.png

 

1.基于抗體的熱啟動DNA聚合酶及其在PCR反應(yīng)體系中的激活提高了特異性。

 

此外,變性步驟還可能分離反應(yīng)配制過程中形成的錯(cuò)配序列和引物二聚體,從而防止它們在后續(xù)退火和延伸過程中被DNA聚合酶擴(kuò)增。這樣,熱啟動DNA聚合酶便可降低非特異性擴(kuò)增,提高產(chǎn)率,可實(shí)現(xiàn)室溫下配制反應(yīng)體系,方便用于高通量實(shí)驗(yàn)應(yīng)用(圖2-4)。

 

圖片2.png

 

2:非熱啟動和熱啟動DNA聚合酶的PCR結(jié)果。使用熱啟動DNA聚合酶,可提高目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)率并減少非特異性擴(kuò)增。

 

圖片3.png

 

3.熱啟動DNA聚合酶適用于室溫下配制反應(yīng)體系,可用于高通量應(yīng)用。準(zhǔn)備PCR反應(yīng)并在室溫下孵育0、24和72小時(shí), 然后放置到熱循環(huán)儀中。即使在室溫配制反應(yīng)體系72小時(shí)后依然能夠高特異性地?cái)U(kuò)增來自人類gDNA的2 kb片段,表明熱啟動DNA聚合酶可適用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。

 

圖片4.png

 

4.聚合酶活性對比:(A)真正的“熱啟動”DNA聚合酶和(B) “暖啟動”DNA聚合酶。在60°C(恒溫)下檢測60分鐘內(nèi)的聚合酶活性。在熱激活測試(藍(lán)色曲線)中,在 94°C下對聚合酶加熱處理2分鐘,使抗體與聚合酶解離。不使用熱激活(紅色曲線)時(shí),真正的熱啟動DNA聚合酶無法檢測到聚合酶活性,而暖啟動酶可在60°C被激活,因此不適用于熱啟動實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

 

作為抗體的替代物,通過對酶活性位點(diǎn)進(jìn)行熱不穩(wěn)定化學(xué)修飾,或者使用適配子等小分子縮短活化時(shí)間,也能夠獲得熱啟動性能。無論是否選擇熱啟動技術(shù),在非加熱條件下有效阻斷DNA聚合酶活性,對確保特異性而言都至關(guān)重要。(圖4)

 

熱穩(wěn)定性

由于熱循環(huán)是DNA擴(kuò)增重復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件的關(guān)鍵特征,因此,所使用DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性非常重要。盡管最初來自于嗜熱菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相對較高的溫度,但是其半衰期在90°C以上時(shí)明顯縮短。當(dāng)使用 長時(shí)間高溫 使具有二級結(jié)構(gòu)和富含GC序列的DNA變性時(shí),這一缺陷便成為一大難題。同樣,在擴(kuò)增長片段模板時(shí),需要更大量的Taq DNA 聚合酶或補(bǔ)充Taq DNA聚合酶,以供長時(shí)間孵育。因此,從超嗜熱菌分離的DNA聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性,將有助于克服這些挑戰(zhàn)。

 

Pfu DNA聚合酶是一種為大家所熟知的超耐熱酶,來自于水熱環(huán)境中的超嗜熱古細(xì)菌 Pyrococcus furiosus 。在95°C下,Pfu聚合酶的穩(wěn)定性能比 Taq 聚合酶高20倍[3]。其它常見的超耐熱DNA聚合酶包括來自古細(xì)菌 Thermococcus 和 Pyrococcus 的KOD和GBD等。

 

盡管古細(xì)菌DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性強(qiáng),但它們在某些方面也具有一定局限性。例如,超耐熱 Pfu DNA 聚合酶的合成能力較低(與 Taq DNA聚合酶相比),因此合成DNA的速度較慢。此外,古細(xì)菌DNA聚合酶無法擴(kuò)增含有尿嘧啶的DNA模板,因?yàn)槠浯嬖谀蜞奏そY(jié)合區(qū)域作為一種DNA修復(fù)機(jī)制[4,5]。含尿嘧啶的DNA序列是 防止PCR 殘余污染 和經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化進(jìn)行 基因座甲基化分析 的基礎(chǔ)。

 

保真度

DNA聚合酶的校正能力決定了保真度,會影響DNA序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。因此,高保真DNA聚合酶就是具有強(qiáng)校正活性的酶。DNA聚合酶準(zhǔn)確復(fù)制DNA序列(即獲得無錯(cuò)誤序列)的能力對分子克隆、測序和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要(應(yīng)用指南:定點(diǎn)突變)。

 

其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性,可校正錯(cuò)誤插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位點(diǎn)與其5′→ 3′聚合酶活性位點(diǎn)是分離的(圖5)。當(dāng)錯(cuò)配的核苷酸插入聚合結(jié)構(gòu)域,DNA合成將因不合適的堿基配對動力學(xué)而暫停。暫停期間,DNA聚合酶將切除錯(cuò)配的核苷酸并用正確的核苷酸替換[6]。

 

圖片5.png

 

5.DNA聚合酶及其 5′→3′聚合酶結(jié)構(gòu)域和3′→5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域(基于 大腸桿菌 DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu))。

 

DNA聚合酶的保真度檢測方法多種多樣,如菌落篩選測定、Sanger測序和下一代測序[7-10]。傳統(tǒng)的菌落篩選方法,是將PCR擴(kuò)增片段( lac 基因的)克隆到質(zhì)粒中。使用 藍(lán)白斑篩選檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落。lac 基因插入片段上的突變(可能由于PCR過程中的錯(cuò)誤復(fù)制產(chǎn)生)導(dǎo)致lacZ功能喪失,形成白色菌落。另一方面,無PCR錯(cuò)誤的 lac 插入片段則形成藍(lán)色菌落。使用Sanger測序?qū)寺〉腜CR片段進(jìn)行測序,可檢測DNA聚合酶的錯(cuò)誤率。利用下一代測序,可直接對PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測序(圖 6)。

 

圖片6.png

 

6.檢測DNA聚合酶保真度的常用方法。

 

DNA聚合酶的保真度常用錯(cuò)誤率的倒數(shù)表示(保真度=1/錯(cuò)誤率),指發(fā)生錯(cuò)配的核苷酸數(shù)與聚合的總核苷酸數(shù)的比值。因此,DNA聚合酶保真度高度依賴于PCR擴(kuò)增子長度和PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。為了準(zhǔn)確對比不同聚合酶的保真度,必須使用相同的方法和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行檢測。

 

通常,保真度表示為與 Taq DNA 聚合酶保真度的相對值。天然存在的校正DNA聚合酶(如 Pfu 和KOD)的保真度約為 Taq聚合酶的10倍。但是,“下一代”高保真DNA聚合酶經(jīng)過定向改造,具有超高的保真度, >約為 Taq 聚合酶的50-100倍(圖7)。使用這些酶,錯(cuò)配率可低至幾百萬分之一。

圖片7.png

 

7.利用下一代測序方法,對比常用的高保真酶。

 

合成能力

酶的合成能力可定義為在一次結(jié)合中處理的核苷酸數(shù)量。DNA聚合酶的合成能力通常反應(yīng)了合成率和合成速度,以及酶與底物的親和力。合成能力高的DNA聚合酶適用于擴(kuò)增長模板、具有二級結(jié)構(gòu)和富含GC的序列,以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制劑的血液和植物組織樣品(圖8)。

圖片8.png

 

8.具有高合成能力的DNA聚合酶能夠有效擴(kuò)增(A)來自人類gDNA的不同長度目標(biāo)序列,(B)各種GC含量(無增強(qiáng)子)的模板以及(C)來自含有常見PCR抑制劑的樣品的目的片段。這些實(shí)驗(yàn)使用了具有高合成能力的 Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ DNA 聚合酶 。

 

早期的高保真DNA聚合酶具有較強(qiáng)的核酸外切酶活性,所以合成能力較低,且會減慢聚合速度。因此,其擴(kuò)增較長目標(biāo)DNA的速度明顯減慢。例如,校正 Pfu DNA聚合酶的保真度是 Taq DNA聚合酶的7倍,但其合成率還不到 Taq聚合酶的一半。使用另一個(gè)蛋白質(zhì)的強(qiáng)DNA結(jié)合域?qū)NA聚合酶進(jìn)行改造后,實(shí)現(xiàn)了合成能力的突破,同時(shí)不影響聚合酶活性(圖9)[10]。這些改進(jìn)型DNA聚合酶的合成能力提高了2-5倍。

 

圖片9.png

 

9.DNA聚合酶的合成能力。(A)高合成能力的DNA聚合酶與其底物的親和力更高,每次結(jié)合能引入更多核苷酸。(B)含有DNA結(jié)合域的DNA聚合酶序列示意圖(Pol=聚合酶結(jié)構(gòu)域, 3-′5′ exo = 3′→ 5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域,DBD=DNA結(jié)合域,N=N末端,C=C末端)。

 

總之,DNA聚合酶的四大特點(diǎn)——特異性、熱穩(wěn)定性、保真度和合成能力——使這些酶具有多種功能,進(jìn)一步拓展了它們在PCR中的應(yīng)用。酶的 特異性 可確保獲得高產(chǎn)率的目標(biāo)PCR產(chǎn)物,同時(shí)盡量減少在克隆和定量等下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中的潛在問題。高合成能力和超耐熱性 克服了擴(kuò)增二級結(jié)構(gòu)、富含GC的序列以及長DNA片段的困難。此外,提高合成能力使酶能夠耐受DNA樣品中天然存在的PCR抑制劑。最后,高保真性提高了序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。

 

 

 

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賽默飛世爾科技(中國)有限公司

 


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