DNA聚合酶在新DNA鏈合成中扮演著重要的角色，是PCR反應(yīng)的組成部分。因此，充分了解聚合酶的特點(diǎn)以及高級DNA酶今后的發(fā)展方向，對于將PCR方法推廣到各種生物學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要。自從在早期PCR實(shí)驗(yàn)中開始使用 賽默飛Taq DNA DNA聚合酶至今，其特異性、熱穩(wěn)定性、保真度和合成能力得到了明顯的改進(jìn)。以下就為您介紹這些改進(jìn)型DNA酶的特點(diǎn)，以及它們與提高PCR實(shí)驗(yàn)效果的密切關(guān)系。

本頁內(nèi)容

l 特異性

l 熱穩(wěn)定性

l 保真度

l 合成能力

特異性

非特異性擴(kuò)增是PCR反應(yīng)最主要的障礙之一，因?yàn)樗鼤@著降低目的基因擴(kuò)增的產(chǎn)率和靈敏度，從而影響擴(kuò)增結(jié)果的合理解釋和下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的成功。而DNA聚合酶經(jīng)常會延伸錯(cuò)配的目的基因和引物二聚體，這是非特異性擴(kuò)增的常見來源。如何減少非特異性擴(kuò)增？方案之一是在冰上配制PCR反應(yīng)。這樣有助于將DNA聚合酶的活性保持在低水平，但在PCR開始之前依然可能會合成不需要的產(chǎn)物。另一個(gè)辦法是將DNA聚合酶的加入時(shí)間推遲到第一個(gè)循環(huán)的退火步驟。因?yàn)橹挥性?0℃以上的初始變性步驟之后才能開始擴(kuò)增，所以該技術(shù)被稱為“熱啟動”。

盡管手動熱啟動程序能夠有效改善特異性，但是其過程不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且會增加樣品污染和降低可重復(fù)性的風(fēng)險(xiǎn)。1994年，具有真正熱啟動特性的TaqDNA聚合酶問世[1,2]，通過在室溫下配制反應(yīng)時(shí)將特異性抗體與聚合酶結(jié)合來抑制其活性。在初始高溫變性步驟（如，>90℃）階段，結(jié)合的抗體失活，從而激活DNA聚合酶（圖1）。

圖 1.基于抗體的熱啟動DNA聚合酶及其在PCR反應(yīng)體系中的激活提高了特異性。

此外，變性步驟還可能分離反應(yīng)配制過程中形成的錯(cuò)配序列和引物二聚體，從而防止它們在后續(xù)退火和延伸過程中被DNA聚合酶擴(kuò)增。這樣，熱啟動DNA聚合酶便可降低非特異性擴(kuò)增，提高產(chǎn)率，可實(shí)現(xiàn)室溫下配制反應(yīng)體系，方便用于高通量實(shí)驗(yàn)應(yīng)用（圖2-4）。

圖 2：非熱啟動和熱啟動DNA聚合酶的PCR結(jié)果。使用熱啟動DNA聚合酶，可提高目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)率并減少非特異性擴(kuò)增。

圖 3.熱啟動DNA聚合酶適用于室溫下配制反應(yīng)體系，可用于高通量應(yīng)用。準(zhǔn)備PCR反應(yīng)并在室溫下孵育0、24和72小時(shí)， 然后放置到熱循環(huán)儀中。即使在室溫配制反應(yīng)體系72小時(shí)后依然能夠高特異性地?cái)U(kuò)增來自人類gDNA的2 kb片段，表明熱啟動DNA聚合酶可適用于大規(guī)模實(shí)驗(yàn)。

圖 4.聚合酶活性對比：(A)真正的“熱啟動”DNA聚合酶和(B) “暖啟動”DNA聚合酶。在60°C（恒溫）下檢測60分鐘內(nèi)的聚合酶活性。在熱激活測試（藍(lán)色曲線）中，在 94°C下對聚合酶加熱處理2分鐘，使抗體與聚合酶解離。不使用熱激活（紅色曲線）時(shí)，真正的熱啟動DNA聚合酶無法檢測到聚合酶活性，而暖啟動酶可在60°C被激活，因此不適用于熱啟動實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

作為抗體的替代物，通過對酶活性位點(diǎn)進(jìn)行熱不穩(wěn)定化學(xué)修飾，或者使用適配子等小分子縮短活化時(shí)間，也能夠獲得熱啟動性能。無論是否選擇熱啟動技術(shù)，在非加熱條件下有效阻斷DNA聚合酶活性，對確保特異性而言都至關(guān)重要。（圖4）

熱穩(wěn)定性

由于熱循環(huán)是DNA擴(kuò)增重復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件的關(guān)鍵特征，因此，所使用DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性非常重要。盡管最初來自于嗜熱菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相對較高的溫度，但是其半衰期在90°C以上時(shí)明顯縮短。當(dāng)使用 長時(shí)間高溫 使具有二級結(jié)構(gòu)和富含GC序列的DNA變性時(shí)，這一缺陷便成為一大難題。同樣，在擴(kuò)增長片段模板時(shí)，需要更大量的Taq DNA 聚合酶或補(bǔ)充Taq DNA聚合酶，以供長時(shí)間孵育。因此，從超嗜熱菌分離的DNA聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性，將有助于克服這些挑戰(zhàn)。

Pfu DNA聚合酶是一種為大家所熟知的超耐熱酶，來自于水熱環(huán)境中的超嗜熱古細(xì)菌 Pyrococcus furiosus 。在95°C下，Pfu聚合酶的穩(wěn)定性能比 Taq 聚合酶高20倍[3]。其它常見的超耐熱DNA聚合酶包括來自古細(xì)菌 Thermococcus 和 Pyrococcus 的KOD和GBD等。

盡管古細(xì)菌DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，但它們在某些方面也具有一定局限性。例如，超耐熱 Pfu DNA 聚合酶的合成能力較低（與 Taq DNA聚合酶相比），因此合成DNA的速度較慢。此外，古細(xì)菌DNA聚合酶無法擴(kuò)增含有尿嘧啶的DNA模板，因?yàn)槠浯嬖谀蜞奏そY(jié)合區(qū)域作為一種DNA修復(fù)機(jī)制[4,5]。含尿嘧啶的DNA序列是 防止PCR 殘余污染 和經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化進(jìn)行 基因座甲基化分析 的基礎(chǔ)。

保真度

DNA聚合酶的校正能力決定了保真度，會影響DNA序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。因此，高保真DNA聚合酶就是具有強(qiáng)校正活性的酶。DNA聚合酶準(zhǔn)確復(fù)制DNA序列（即獲得無錯(cuò)誤序列）的能力對分子克隆、測序和定點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用至關(guān)重要（應(yīng)用指南：定點(diǎn)突變）。

其校正活性基于其 3′ → 5′核酸外切酶活性，可校正錯(cuò)誤插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位點(diǎn)與其5′→ 3′聚合酶活性位點(diǎn)是分離的（圖5）。當(dāng)錯(cuò)配的核苷酸插入聚合結(jié)構(gòu)域，DNA合成將因不合適的堿基配對動力學(xué)而暫停。暫停期間，DNA聚合酶將切除錯(cuò)配的核苷酸并用正確的核苷酸替換[6]。

圖 5.DNA聚合酶及其 5′→3′聚合酶結(jié)構(gòu)域和3′→5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域（基于 大腸桿菌 DNA聚合酶I的結(jié)構(gòu)）。

DNA聚合酶的保真度檢測方法多種多樣，如菌落篩選測定、Sanger測序和下一代測序[7-10]。傳統(tǒng)的菌落篩選方法，是將PCR擴(kuò)增片段（ lac 基因的）克隆到質(zhì)粒中。使用 藍(lán)白斑篩選檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌落。lac 基因插入片段上的突變（可能由于PCR過程中的錯(cuò)誤復(fù)制產(chǎn)生）導(dǎo)致lacZ功能喪失，形成白色菌落。另一方面，無PCR錯(cuò)誤的 lac 插入片段則形成藍(lán)色菌落。使用Sanger測序?qū)寺〉腜CR片段進(jìn)行測序，可檢測DNA聚合酶的錯(cuò)誤率。利用下一代測序，可直接對PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測序（圖 6）。

圖 6.檢測DNA聚合酶保真度的常用方法。

DNA聚合酶的保真度常用錯(cuò)誤率的倒數(shù)表示（保真度=1/錯(cuò)誤率），指發(fā)生錯(cuò)配的核苷酸數(shù)與聚合的總核苷酸數(shù)的比值。因此，DNA聚合酶保真度高度依賴于PCR擴(kuò)增子長度和PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。為了準(zhǔn)確對比不同聚合酶的保真度，必須使用相同的方法和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行檢測。

通常，保真度表示為與 Taq DNA 聚合酶保真度的相對值。天然存在的校正DNA聚合酶（如 Pfu 和KOD）的保真度約為 Taq聚合酶的10倍。但是，“下一代”高保真DNA聚合酶經(jīng)過定向改造，具有超高的保真度， >約為 Taq 聚合酶的50-100倍（圖7）。使用這些酶，錯(cuò)配率可低至幾百萬分之一。

圖 7.利用下一代測序方法，對比常用的高保真酶。

合成能力

酶的合成能力可定義為在一次結(jié)合中處理的核苷酸數(shù)量。DNA聚合酶的合成能力通常反應(yīng)了合成率和合成速度，以及酶與底物的親和力。合成能力高的DNA聚合酶適用于擴(kuò)增長模板、具有二級結(jié)構(gòu)和富含GC的序列，以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制劑的血液和植物組織樣品（圖8）。

圖 8.具有高合成能力的DNA聚合酶能夠有效擴(kuò)增(A)來自人類gDNA的不同長度目標(biāo)序列，(B)各種GC含量（無增強(qiáng)子）的模板以及(C)來自含有常見PCR抑制劑的樣品的目的片段。這些實(shí)驗(yàn)使用了具有高合成能力的 Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ DNA 聚合酶 。

早期的高保真DNA聚合酶具有較強(qiáng)的核酸外切酶活性，所以合成能力較低，且會減慢聚合速度。因此，其擴(kuò)增較長目標(biāo)DNA的速度明顯減慢。例如，校正 Pfu DNA聚合酶的保真度是 Taq DNA聚合酶的7倍，但其合成率還不到 Taq聚合酶的一半。使用另一個(gè)蛋白質(zhì)的強(qiáng)DNA結(jié)合域?qū)NA聚合酶進(jìn)行改造后，實(shí)現(xiàn)了合成能力的突破，同時(shí)不影響聚合酶活性（圖9）[10]。這些改進(jìn)型DNA聚合酶的合成能力提高了2-5倍。

圖 9.DNA聚合酶的合成能力。(A)高合成能力的DNA聚合酶與其底物的親和力更高，每次結(jié)合能引入更多核苷酸。(B)含有DNA結(jié)合域的DNA聚合酶序列示意圖（Pol=聚合酶結(jié)構(gòu)域， 3-′5′ exo = 3′→ 5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域，DBD=DNA結(jié)合域，N=N末端，C=C末端）。

總之，DNA聚合酶的四大特點(diǎn)——特異性、熱穩(wěn)定性、保真度和合成能力——使這些酶具有多種功能，進(jìn)一步拓展了它們在PCR中的應(yīng)用。酶的 特異性 可確保獲得高產(chǎn)率的目標(biāo)PCR產(chǎn)物，同時(shí)盡量減少在克隆和定量等下游實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中的潛在問題。高合成能力和超耐熱性 克服了擴(kuò)增二級結(jié)構(gòu)、富含GC的序列以及長DNA片段的困難。此外，提高合成能力使酶能夠耐受DNA樣品中天然存在的PCR抑制劑。最后，高保真性提高了序列復(fù)制的準(zhǔn)確性。

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