一、背景

小鼠巨噬細胞是一種存在于小鼠體內的免疫細胞，也稱為巨噬細胞系。巨噬細胞是一種多能性干細胞，可以分化為多種類型的細胞，包括樹突狀細胞、粒細胞和單核細胞等。

小鼠巨噬細胞在免疫系統中起著重要的作用。它們可以吞噬和消化細菌、病毒和其他微生物，從而保護機體免受感染。此外，巨噬細胞還可以分泌多種細胞因子和趨化因子，調節免疫反應的發生和發展。

在醫學研究中，小鼠巨噬細胞被廣泛用于研究免疫系統的功能和疾病機制。例如，通過將特定的基因導入小鼠巨噬細胞中，可以研究這些基因對免疫系統的影響。此外，由于小鼠和人類的免疫系統存在一定的相似性，因此小鼠巨噬細胞也被用于研究人類免疫相關疾病的發病機制和治療方法。

二、小鼠巨噬細胞培養操作

1)復蘇小鼠巨噬細胞：以下細胞培養凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。

將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2)小鼠巨噬細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，使消化液浸潤所有細胞，棄去消化液，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養液后吹勻。

d、將細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養基的新皿中或者瓶中，置于培養箱中培養。

3)小鼠巨噬細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例；

a、收集細胞及細胞培養液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

三、應用

小鼠巨噬細胞可以用于賈第蟲胞外囊泡激活小鼠巨噬細胞NLRP3炎性小體的分子機制：

分離鑒定賈第蟲胞外囊泡(GEVs),從GEVs誘導小鼠巨噬細胞細胞炎性應答角度研究,分析參與這一過程的關鍵炎性小體及其激活的分子機制;并分析GEVs中的蛋白質組份信息,確定激活NLRP3炎性小體的單分子;最后通過動物試驗,確定GEVs關鍵分子介導的NLRP3炎性小體激活對蟲體感染的影響,進一步揭示其在賈第蟲致病中的作用。

1) GEVs刺激小鼠巨噬細胞模型建立。超速離心富集賈第蟲滋養體分泌的GEVs,透射電鏡下呈典型“杯狀”結構,粒徑大小為150 nm;激光共聚焦觀察GEVs能夠被宿主細胞主動吞噬進入胞內,并呈現時間依賴性;熒光定量PCR和ELISA實驗測定GEVs能夠激活小鼠腹腔巨噬細胞炎性應答,并引起多種炎性細胞因子和趨化因子轉錄及分泌水平升高,且呈現劑量依賴性。結果表明賈第蟲能夠分泌GEVs,且可以進入宿主細胞內激活宿主細胞炎性應答。

2) 2)GEVs激活宿主小鼠巨噬細胞PRRs分子類型鑒定。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞后引起多種NLRs和TLRs轉錄水平升高,其中NLRP3和TLR2升高顯著;GEVs刺激使NLRP3受體呈現點狀激活并聚集于細胞核周圍、TLR2受體大量表達于細胞膜上;通過鉀離子外流和溶酶體損傷途徑阻斷NLRP3受體和阻斷TLR2受體均可以顯著下調多種炎性細胞因子和趨化因子轉錄水平、多種炎性細胞因子分泌水平和IL-1βp17蛋白表達水平。結果表明GEVs通過激活宿主TLR2和NLRP3信號通路調控宿主巨噬細胞炎性應答。

3) GEVs激活小鼠巨噬細胞炎性小體第二信號的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞引起NLRP3炎性小體關鍵蛋白基因轉錄水平升高,在感染后6 h～24 h范圍內caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現先升高到12 h達到峰值然后降低的趨勢,在12.5μg～25μg范圍內caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈現劑量依賴性升高;通過阻斷鉀離子外流途徑、溶酶體損傷途徑、caspase-1活化途徑、泛caspase-1激活途徑阻斷NLRP3炎性小體激活,可以不同程度下調IL-1β的基因轉錄、蛋白分泌和表達,且溶酶體損傷途徑和泛caspase-1途徑更為顯著;阻斷IL-1β后能夠顯著下調其它炎性細胞因子IL-6和TNF-α的轉錄和分泌水平。結果表明GEVs能夠通過溶酶體損傷途徑激活宿主NLRP3炎性小體,調控IL-1βp17的分泌并介導宿主炎性應答。

4)GEVs激活小鼠巨噬細胞炎性小體信號的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬細胞和THP-1細胞均能促進賈第蟲介導的NLRP3炎性小體信號pro-IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉錄和分泌;GEVs刺激宿主細胞,在0h～4 h內,引起p38在2 h磷酸化水平達到峰值、ERK和AKT在4 h磷酸化達到峰值,阻斷p38和ERK通路可以顯著下調IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉錄和分泌,而阻斷AKT通路可以顯著上調這些炎性因子的轉錄和分泌;GEVs刺激宿主細胞,可引起NF-κB p65入核,在0 h～4 h內,引起p-p65和p-IKKαβ均在1 h磷酸化水平達到峰值而T-IκBα降解至水平,阻斷IκBα磷酸化來抑制NF-κB通路可以顯著下調NLRP3炎性小體信號IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的轉錄和分泌。

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