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蛋白測序是解析蛋白質氨基酸排列順序的核心技術，主要分為傳統化學法、質譜分析法和新興單分子技術三大類。以下是主流方法的原理、流程及適用場景詳解：
?? 一、傳統化學法：Edman降解
原理：
從蛋白質N端逐級切割氨基酸，通過苯異硫氰酸酯（PITC）標記→環化裂解→HPLC鑒定釋放的氨基酸衍生物（PTH-AA）。
流程：
變性處理：用6M鹽酸胍解開蛋白高級結構
N端封閉：乙酰化防止非目標反應
循環反應：
堿性條件與PITC結合
無水三裂解N端氨基酸
萃取PTH-AA進行HPLC分析
特點：
? 優勢：可測N端15-60個氨基酸（純度＞95%時）
? 局限：
不能處理N端封閉蛋白（如乙酰化蛋白）
通量極低（1樣本/小時）
需≥10 pmol純化蛋白
應用場景：抗體CDR區短肽驗證、重組蛋白N端質檢
?? 二、質譜分析法（主流技術）
1. 自上而下（Top-Down）
原理：
完整蛋白離子化（電噴霧ESI）→高分辨質譜（如Orbitrap/FT-ICR）直接測序。
流程：
特點：
保留翻譯后修飾（PTM）信息
需超高性能質譜（分辨率＞100,000）
適用分子量＜50 kDa蛋白
2. 自下而上（Bottom-Up）
原理：
蛋白酶解→肽段分離→串聯質譜（MS/MS）測序→算法拼接。
關鍵步驟：
酶解：Trypsin（切割K/R位點）、Lys-C等
色譜分離：nanoLC梯度洗脫（C18柱）
碎裂方式：
類型 適用場景 特點
CID（碰撞誘導解離） 小肽段（＜2 kDa） 易丟失修飾信息
ETD（電子轉移解離） 磷酸化/糖基化修飾 保留不穩定修飾
HCD（高能碰撞） 通用型（靈敏度高） 碎片覆蓋全面
數據庫搜索工具：
Mascot、MaxQuant（標記定量）
de novo算法：PEAKS（無需數據庫）
特點：
通量高（可并行數百樣本）
需μg級蛋白起始量
可定位修飾位點（如磷酸化Ser/Thr）
?? 三、單分子測序技術
1. 納米孔蛋白測序（Oxford Nanopore）
原理：
蛋白變性為線性多肽→通過納米孔時引起電流變化→AI解碼氨基酸序列。
突破性：
直接讀取翻譯后修飾（如磷酸化酪氨酸電流特征）
2023年實現單分子精度（誤差＜5%）
2. 熒光標記測序（Fluorosequencing）
流程：
將20種氨基酸分為5組，每組用特異熒光染料標記
蛋白固定于載玻片，逐輪切除N端氨基酸
每輪顯微成像識別熒光顏色→對應氨基酸組
特點：
適合低豐度蛋白（zeptomole級）
商業平臺：Erisyon™（2024年推出）
?? 四、方法選擇決策樹
?? 五、前沿進展與挑戰
AI輔助：
AlphaFold2預測結構輔助序列驗證
DeepMSn實現95%準確度的de novo測序
挑戰：
膜蛋白等難溶樣本的處理
同分異構體（如Leu/Ile）區分
單氨基酸變異（SAV）檢測限＞0.1%
實用建議：
常規研究Bottom-Up質譜（成本≈¥800/樣本）
抗體藥物開發需結合Edman降解+質譜
探索性研究關注納米孔實時測序（通量＞100樣本/天）
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