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自動聚焦顯微鏡怎么用?

來源:上海西努光學科技有限公司   2025年07月09日 14:13  
 以下是自動聚焦顯微鏡的詳細操作指南,涵蓋通用流程、進階技巧及常見問題處理:

?? 一、基礎操作流程(以生物樣本為例)
開機準備

開啟主機電源,啟動電腦控制軟件(如Olympus cellSens/蔡司ZEN)

安裝合適物鏡(10×觀察定位,40×/100×油鏡精細聚焦)

載物臺調平:放置水平校準玻片,旋轉調平螺絲至液滴不流動

樣本放置與初聚焦

滴浸沒液:油鏡用香柏油,水鏡用蒸餾水(避免氣泡)

粗調焦旋鈕抬升載物臺,目視下使物鏡逼近樣本(距離≈0.5mm)

切換自動聚焦:軟件點擊AF按鈕或硬件按AF鍵

自動聚焦模式選擇

模式適用場景操作要點
表面反射AF金屬、硅片等反光材料需開啟落射光,強度調至70%
透射光對比AF細胞切片、透明薄膜關閉聚光鏡虹彩光圈至80%孔徑
激光共焦AF厚樣本(>50μm)分層聚焦設置Z軸步進0.5-1μm
參數優化(關鍵!)

靈敏度:調至80-90%(過高易抖動,過低漏檢)

搜索范圍:設置為預估焦距±20μm(縮短定位時間)

聚焦算法:

明場選梯度大化

熒光選強度峰值(避免光漂白)

?? 二、進階功能應用
多區域自動聚焦(大樣本拼接)

步驟:

軟件點擊創建網格,劃分5×5掃描區域

每個區域中心點執行AF并保存Z坐標

啟用曲面擬合生成三維聚焦平面

效果:消除載玻片彎曲誤差,拼接縫隙≤2μm

時序動態聚焦(活細胞觀測)

開啟溫度CO?維持(37℃/5% CO?)

設置:

聚焦間隔:30秒/次

焦點容差:±0.8μm(避免頻繁調整)

防漂移技術:激活硬件閉環反饋(如蔡司Definite Focus)

三維重建操作

三維重建操作

 

??? 三、日常維護與校準
每周維護

物鏡清潔:用二甲苯-無水乙醇(7:3)混合液擦拭油鏡

載物臺導軌:涂抹真空脂(型號:Krytox GPL205)

校準:

使用USAF1951分辨率板校驗MTF(調制傳遞函數)

10×物鏡中心偏差≤0.5μm

聚焦失靈處理

故障現象                      原因                             解決方案
AF反復掃描不停止          樣本對比度過低     染色/調節虹彩光圈
焦點周期性抖動        環境振動>5Hz             啟用防振臺(≥200kg)
Z軸定位偏差>3μm        線性編碼器污染     用無塵布蘸乙醇清潔導軌
? 四、各品牌關鍵差異
功能                 奧林巴斯                蔡司                             舜宇
最快AF速度0.3秒(IXplore)0.25秒(Axio)     0.8秒(NE900)
熒光AF通道支持4色激光        支持6色激光             支持3色LED
特色技術       TruFocus溫度補償Definite Focus防漂     SmartStep多算法
?? 操作黃金法則
浸沒液禁忌:

水鏡勿用油,油鏡禁用水,否則球差增大3倍!

環境控制:

溫度波動≤1℃/h,濕度50%±5%(防止透鏡結露)

數據可靠性:

每日使用前用標準微球(如NIST SRM 1960)驗證Z軸重復性(RSD<0.8%)

當自動聚焦失效時,立即切換手動模式并檢查:

物鏡螺紋是否松動 → 擰緊扭矩0.4N·m

樣本是否超出物鏡工作距離 → 油鏡WD=0.13mm

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