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從手動到自動:Countess細胞計數儀與血球計數板的性能比較-賽默飛

來源:賽默飛世爾科技(中國)有限公司   2025年07月08日 17:46  


在細胞生物學研究中,細胞計數是一項基礎但至關重要的實驗步驟,直接影響實驗的可重復性和準確性。傳統的血球計數板(Hemocytometer)長期以來是實驗室的標準工具,但隨著技術的發展,自動細胞計數儀逐漸成為更高效、更準確的選擇。本文將對兩種方法進行詳細對比,以便實驗者有更清晰的了解

 

血球計數板的計數方法與操作

1. 血球計數板的結構

血球計數板(Hemocytometer)是一種特制載玻片,通過精密蝕刻的網格系統實現細胞的手動計數和濃度計算。計數區由 9個1mm×1mm大方格 組成,四角的大方格分成16個中型方格,中央大方格分成400個小格(一般是16個中格 x 25個小格)。計數室深度固定為 0.1mm,因此每個大方格的體積為 0.1μL或者0.1mm31mm×1mm×0.1mm)

 

2. 細胞分布假設

通過統計特定區域內的細胞數量,推算整體濃度(細胞數/mL)。基于泊松分布原理,要求細胞均勻分布且無聚集。如遇成團細胞,或者有細胞碎片,可能會影響到計數結果。

 

3. 操作步驟

樣本制備:將細胞懸液稀釋至合適濃度(通常 10?10? cells/mL)。

加樣:取 10 µL 細胞懸液(如需染色,混合10μL細胞懸液 + 10μL臺盼藍)柔吹打或倒置混勻。用移液器將 10μL 混合液滴加至計數板蓋玻片邊緣,依靠毛細作用填充計數室液體應自然鋪滿計數區,無氣泡(否則需重做)

顯微鏡觀察一般 10× 或 20× 物鏡下觀察,計數中央大方格內四角4個中方格的細胞數量。為了防止相鄰的方格間重復統計,壓在方格線上的細胞遵循記上不記下,記左不記右的原則。

計算濃度                                       

16個中格x 25個小格為例,四角的4個中格中一共有4x25 個(100個)小格。

每小格細胞均數=100格細胞總數 ÷ 100

細胞濃度(cell/mL)=小方格中細胞平均數x400 x 10 x 1000 x 稀釋倍數

其中:

中央大方格的細胞數=小方格細胞平均數x400 (0.1mm3

x 10 轉換為 1mm3 中的細胞數

x 1000 轉換為 1cm31mL)中的細胞數

 

血球計數板的計算公式本質
將局部計數換算到 1 mL 體積,核心在于:

1. 數清細胞數 × 稀釋倍數。

2. 除以實際計數的體積(通過選定方格區域和方格數)。

 

血球計數板的局限性

1. 主觀性強:依賴操作者的經驗,不同實驗者可能得出不同結果。比如如果細胞較大,有的實驗者可能依然使用中央大方格,有的實驗者可能或選擇四角的4個大方格;壓線細胞的計數和成團細胞的計數也可能因人而異。

2. 耗時:每個樣本需 3–5 分鐘,重復計數更費時。

3. 誤差大

· 細胞分布不均導致計數偏差。

· 成團細胞難以準確分辨。

· /死細胞判斷依賴臺盼藍染色,顯微鏡下顏色差異不大,不容易區分,易受主觀影響。

 

隨著成像技術的進步,細胞計數已實現自動化,從而在更短的時間和更少的努力下提供更高的準確性和可靠性。。

 

Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀與血球計數板的細胞計數對比

 

細胞計數準確性
主觀性導致的變異性
無論采用何種細胞計數方法,依賴操作員的判斷都會導致結果誤差。顯微鏡和某些自動細胞計數儀的光強度和焦距設置具有主觀性,可能導致結果不一致。操作員還需決定哪些對象應納入或排除在細胞計數中。如果測量細胞活性,操作員還需判斷哪些細胞應計為死細胞或活細胞。手動計數中的這些主觀變量可能導致不同操作員之間的結果差異較大。

Countess 3 和 Countess 3 FL 細胞計數器可以消除許多主觀變量并節省時間。這些儀器采用先進算法自動確定最佳焦距和光強度,并通過定量測量(如細胞大小、亮度和圓度)來篩選細胞,而非依賴操作員的判斷,從而減少主觀性誤差并提高樣本和用戶間的重復性(圖1)。

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1. 血球計數板 Countess 3 FL 儀器的用戶間變異性比較。三名實驗者員分別使用 Countess 3 FL 細胞計數器對 PBMC、CHO-K1、HeLa、HEK293 和 Jurkat 細胞的單一樣本進行計數,隨后使用血球計數板和顯微鏡手動計數。血球計數板的用戶間變異性顯著高于 Countess 3 FL 儀器。

 

計數的細胞數量
在實際操作中,許多研究人員未計數足夠數量的細胞,導致細胞計數結果不可靠且標準差較高。為了節省手動計數時間,許多用戶僅計數傳統血細胞計數儀網格中的一兩個方格。增加計數方格(即更大的面積)通常會提高結果的一致性,但需要更多時間。Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀在10秒的計數時間內可覆蓋近四個傳統血細胞計數儀方格的等效面積,從而通過減少細胞分布變異的影響提高計數一致性(圖2)。

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2. 計數面積。Countess 3 儀器的計數面積與傳統血細胞計數儀的對比。

 

重復計數

無論采用何種細胞計數方法,多次重復計數均可減少樣本的變異性。Countess 3 和 Countess 3 FL 儀器可在血細胞計數儀完成一次計數(最多5分鐘)的時間內完成多次重復計數,從而提高結果的準確性和可信度。由于時間限制,尤其是在需要計數多個細胞樣本時,重復計數常被手動計數方法忽略。

 

成團細胞

對于含有成團細胞的樣本,手動計數和某些自動細胞計數儀難以獲得準確結果。成團細胞的常見挑戰在于如何區分細胞邊界以確定團塊中的細胞數量。某些自動細胞計數儀僅能準確計數不超過五個細胞的團塊。Countess 3 和 Countess 3 FL 儀器的先進計數算法可清晰識別復雜細胞團塊中的邊界,從而提供準確的細胞計數(圖3)。

除了識別團塊中的單細胞外,Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀還能檢測細胞聚集并測量樣本中的總聚集百分比。屏幕顯示通過不同顏色區分團塊和單細胞,明場模式則可直觀確認團塊中的細胞。

 

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3. 即使樣本中存在成團細胞,仍能獲得準確計數。Countess 3 細胞計數器的分割和計數算法成功解析了 U2OS 人骨肉瘤細胞樣本中的團塊,并顯示樣本中的聚集百分比。

 

熒光細胞計數
熒光細胞計數相比非熒光方法具有多項優勢:背景對比度更高,便于識別和計數細胞;可使用不同熒光標記區分和計數多種細胞類型;減少將碎片誤判為細胞的可能性,從而提高結果準確性。

Countess 3 FL 自動細胞計數儀配備兩個可選的可互換熒光通道,通過插入不同光立方收集顏色(提供超過20種光立方)。儀器自動確定最佳照明條件,并支持兩種計數模式:明場和熒光。明場模式利用明場圖像識別細胞并快速報告熒光陽性細胞百分比;熒光模式則通過一個或兩個熒光通道計數所有熒光對象,并報告總計數及各通道的熒光細胞分布(圖4)。

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4. 使用 Countess 3 FL 自動細胞計數儀和兩個光立方進行熒光細胞計數。細胞經 Invitrogen™ ReadyCount™ 綠/紅細胞活性染色(貨號 A49905)后,采用兩種方法計數:(A)明場模式下的 U2OS 細胞,顯示所有識別細胞;(B)熒光模式下的 PBMC,僅顯示熒光陽性細胞。

 

節約成本
采用自動細胞計數儀的阻礙之一是專用一次性載玻片的持續成本。血細胞計數儀可無限次清洗和重復使用,而許多自動系統需依賴一次性載玻片。Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀設計兼容可重復使用的玻璃載玻片(圖5),同時也支持一次性載玻片。這一創新使實驗室能夠在無需承擔高昂耗材成本的情況下采用先進的細胞計數方法。

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5. Countess 3 FL 自動細胞計數儀的可重復使用載玻片有助于降低耗材成本。

 

節省時間
手動計數(最多5分鐘)與 Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀(幾十秒)的時間差常被忽視。若每天計數五張載玻片(每張兩個樣本),改用自動計數器搭配可重復使用載玻片每月可節省約10小時;使用一次性載玻片則可節省約15小時(圖6)。這些時間可用于實驗室的其他工作,從而顯著提升效率。

 

 

 

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6. 從手動計數切換到自動細胞計數儀后,每月預估節省的時間

 

可獲取的信息
血細胞計數儀僅能提供樣本中的總細胞數、活細胞數和死細胞數。自動細胞計數儀還可獲取更多數據,如平均細胞大小、基于熒光強度或細胞大小的分布直方圖(圖7)。Countess 3 和 Countess 3 FL 儀器可將數據以 CSV 格式保存至 USB 驅動器,原始圖像和結果界面也可保存并傳輸至電腦。

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7. 結果顯示平均細胞大小和細胞大小分布,有助于靶向特定細胞群。

 

Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀與血球計數板的細胞計數對比總結
自動細胞計數相比手動計數具有顯著優勢,包括更高的準確性、簡化的工作流程和大幅節省的時間。盡管存在這些優勢,一次性載玻片的成本曾是采用自動細胞計數技術的障礙。Countess 3 和 Countess 3 FL 自動細胞計數儀兼容可重復使用載玻片,降低了自動細胞計數的成本,使更多實驗室能夠負擔這一先進技術,從而獲得更快、更準確的計數結果。

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對于需要 高通量、高準確性 的現代實驗室,Countess 3 自動細胞計數儀 是比傳統血球計數板更優的選擇。它不僅解決了手動計數的固有缺陷(如主觀性和低效性),還通過 自動化、熒光分析和可重復使用耗材 進一步降低了實驗成本。

 

Countess 自動細胞計數儀特點

引入人工智能,助力 Countess 3 全自動細胞計數儀像細胞生物學家那樣“思考”,從而以簡單、快速并且以自動方式生成準確、可重復的計數結果。其應用范圍不僅限于計數,還擴展到細胞活性、細胞凋亡、轉染效率等方面。

 

準確且精確

當您使用自動化設備進行細胞計數時,它的準確性和精確度和您一樣,甚至更佳。準確性意味著它會正確地進行細胞計數,精確度意味著無論操作者是誰,它每次都會產生相同的結果。

 

引入人工智能。Countess 3(明場)和 Countess 3 FL(明場和熒光)全自動細胞計數儀值得信任,它們使用深度學習神經網絡算法開發,每次都能進行準確的計數。該算法是由專業科學家根據包含數十種不同細胞類型和樣品的數百個培養板進行細胞識別優化而成。

 

由此打造的細胞計數儀能夠像細胞生物學家一樣“思考”,即便是外周血單核細胞 (PBMC)、成團細胞以及含細胞碎片等具有挑戰性的細胞樣品也可輕松勝任。在高分辨率的 Countess 屏幕上,您可以看到正在計數的細胞以及未計數的細胞碎片。

 

與手動血球計數板的計數相比,使用 Countess 3 進行自動化細胞計數可以減少多種原因造成的數據錯誤和差異,包括操作者主觀性、視覺疲勞、計數區域差異和挑戰性樣本。Countess 3 細胞計數儀兼具手動細胞計數的準確性和流式細胞儀計數的精確度,而又無需流式細胞術所需的支出或培訓。

 

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機器學習算法可實現準確的細胞計數,可與流式細胞儀計數媲美。

使用 Attune NxT 流式細胞儀(紫色直方圖)、Countess 3 FL 全自動細胞計數儀(紅色直方圖)以及血球計數板和顯微鏡(手動計數,灰色直方圖)對 CHO-K1、HeLa、HEK293、Jurkat 和人 PBMC 進行了計數。 Countess 3 FL 儀器和血球計數板直方圖代表了 6 個獨立計數的平均值且高度一致。手動計數的誤差(計數的標準差)要比 Countess 3 計數或流式細胞儀計數更寬。

 

擴展計數區域。為了節省手動計數的時間,許多實驗人員只對血球計數板網格上的一個或兩個方塊進行計數。計算更多方塊(更大區域)通常會獲得更準確的結果,但需要額外增加時間。Countess 3 全自動細胞計數儀查詢的區域接近包含四個方塊,通過減少細胞分布變化的影響提高了準確性。并且 Countess 可以在不到 30 秒的時間內完成自動聚焦、自動亮度調整、圖像采集和計數。

 

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手動細胞計數與自動化細胞計數的計數區域對比

Countess 3 的計數區域約為標準血球計數板的 3.8 倍。

 

處理成團細胞和碎片。由于難以辨別細胞之間的邊界,因此成團細胞難以進行手動計數,甚至對自動化計數儀也具有挑戰性。樣品含有碎片則進一步增加了計數的復雜性。Countess 3 全自動細胞計數儀可以在進行細胞計數時自動排除碎片,其先進的算法可以清楚地識別細胞團塊內的細胞邊界,從而實現高度準確的細胞計數。

 

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先進的算法可實現對成團細胞和樣品碎片的準確計數。

在明場模式下使用 Countess 3 FL 全自動細胞計數儀對微小且容易成團的 RAW(小鼠小噬細胞)進行了計數。計數算法能分辨出團塊中的細胞,正確圈出細胞并對細胞進行計數。活細胞具有綠色輪廓,死細胞則具有紅色輪廓。碎片(未勾勒輪廓)會在計數時自動忽略。

 

快速

Countess 3 全自動細胞計數儀能在不到30 秒的時間內產生結果。通過快速采集、自動亮度調整、自動聚焦和自動保存,用戶需要做的就是加入樣品和插入細胞計數板。細胞培養實驗室的時間十分珍貴,使用 Countess 3 自動細胞計數儀,即可快速完成細胞計數等多種分析。              

 

除了計數速度飛快外,Countess 3 系統還精簡了細胞計數的流程,淘汰了許多與手動細胞計數相關的繁瑣步驟,其中包括亮度和聚焦調整、計算細胞濃度以及制作報告。節省了更多的時間。如果您的實驗室每天計數五張玻片,可以每月節省 10–15 小時(具體取決于所選玻片);如果您每天計數 25 張玻片,則可以節省 50–75 小時!這些額外獲得的時間可以用來完成實驗室的細胞培養處理和其他活動,在從手動細胞計數切換到全自動細胞計數方面具有顯著優勢。

 

簡單

使用 Countess 3 或 Countess 3 FL 全自動細胞計數儀在明場模式下進行細胞計數的過程簡單而又輕松。只需準備計數板,啟用快速捕獲和自動保存,然后插入計數板。其余工作交給儀器自動完成:亮度調整、聚焦和計數。

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自動化細胞計數不僅比手動計數操作更簡單,而且需要的操作培訓也更少。

 

靈敏的觸摸屏和直觀的界面。直觀易用的Countess 3 全自動細胞計數儀軟件。靈敏的 LCD 觸摸屏不需要外部計算機。該屏幕的 1280 x 800 分辨率提供高質量的細胞圖像,可通過輔助工具進行活/死細胞計數,使用 Countess 3 FL 全自動細胞計數儀,可實現熒光可視化。顯示屏與整個儀器齊平,便于清潔。

 

觸摸屏界面可以輕松顯示計數的細胞群,例如,創建“門”,根據細胞大小、亮度、圓度和/或熒光強度從計數中排除不需要的細胞。  通過選擇結果屏幕右上角的圖形圖標,在直方圖或散點圖中查看您的細胞信息。當使用滑塊控件調整門控參數時,您可以實時查看直方圖或散點圖的變化。為方便起見,柱狀圖底部顯示平均細胞大小(用于明場計數)或熒光強度(用于熒光計數)。

 

觸摸屏界面可以讓您從結果屏幕快速移動到直方圖和散點圖屏幕。 直方圖和散點圖可根據大小、亮度和圓度顯示細胞群和設門。

 

直觀的設門界面

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在此散點圖中,細胞群被視為活(綠色)和死(紅色)群。軸的大小和圓度可以改變。

 

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在此直方圖中,根據細胞數量和相對熒光單位 (RFU) 繪制細胞群。使用右側的設門場和明場 (BF),您可以使用設門菜單左側的滑塊根據大小、亮度和圓度進行設門。如果選擇德州紅 (TX Red) 或 GFP,則可以執行 RFU 強度的設門。

 

自動

使用 Countess 3 全自動細胞計數儀時,不僅計數自動化完成,系統還會自動調整亮度和聚焦以獲得最佳對比度和分辨率,并會自動保存細胞計數和數據(如果您選擇該選項)。軟件還包括方便的內置預稀釋和細胞傳代計算器,這些為細胞培養工作提供很大便利。

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預稀釋計算器

如果您的細胞樣品是濃縮樣品,您在計數前進行了稀釋,請在此處輸入樣品和緩沖液體積,Countess 3 細胞計數儀會自動重新計算樣品濃度。該濃度還將考慮添加臺盼藍進行明場活性測定。

 

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細胞傳代計算器

如果您的下游實驗確定特定濃度的樣本,請在此處輸入所需濃度和體積、Countess 3 細胞計數儀將自動計算所需的細胞樣品和緩沖液或細胞培養基量。計算時將自動包括您的細胞計數結果。

 

保存結果和報告。您可以將細胞計數結果、細胞數據和圖像保存到 USB 驅動器,或使用 Wi-Fi 保存到 Thermo Fisher™ Connect 云端平臺。結果保存為兼容電子表格的 CSV 文件,細胞數據保存為流式細胞儀標準 FCS 文件,而圖像可以保存為 TIFF、PNG 或 JPG 格式。在實驗室內外隨時訪問這些文件——您可以在需要時隨時隨地獲得數據。

 

您還可以保存包含結果、圖像和設置可打印的 PDF 報告。

 

不局限于計數的應用

Countess 3 全自動細胞計數儀的功能遠非單純的細胞計數。利用臺盼藍染色,您可以評估樣本中活細胞的百分比。或者,使用 Countess 3 FL 系統檢測熒光染料,進行更復雜的活性分析、檢測凋亡和細胞死亡的不同階段、測量轉染效率,以及其他應用。

 

單細胞數據。Countess 3 全自動細胞計數儀可分析和存儲您樣品中每個細胞的數據。您可以放大任何細胞并顯示其大小、亮度、圓度和熒光值。您還可以流式細胞儀標準 (FCS) 格式生成散點圖,并在多種流式細胞儀軟件分析程序中分析、轉換數據和重新設置數據格式。

 

多樣化的細胞系和細胞樣品。Countess 3 全自動細胞計數儀的計數算法已在一組不同的細胞樣本上進行了訓練,您可以相信Countess 3 全自動細胞計數儀能夠實現高準確度的細胞計數。下表列示了在 Countess 3 和 Countess 3 FL 全自動細胞計數儀上進行了測試和驗證的細胞類型和細胞系。

 

兼容可重復使用計數板

兩種 Countess 3 自動細胞計數儀均可使用 Invitrogen Countess 可重復使用計數板,可重復計數板可避免一次性計數板的浪費。即使您的實驗室每天只使用五張計數板,通過使用可重復使用的計數板,可顯著減少每年造成的浪費。這使得實驗室能夠負擔起細胞計數自動化的成本,不會產生一次性計數板的持續性花費。

 

Invitrogen Countess 細胞計數板一次性計數板,無需像可重復計數板那樣進行清潔,然后在細胞樣品的處理間隔等待其干燥。需要處理大量細胞樣品,為了減少污染風險或處理有害樣本時,一次性計數板使用方便,可快速處理細胞樣品。

 

符合 21 CFR 第 11 部分要求的支持軟件

Countess SAE 軟件解決方案是一個選配軟件模塊,支持電子記錄保存,符合美國食品和藥品監督管理局(FDA)的“電子記錄和簽名規則”、“聯邦法規”第 21 篇第 11 部分(21 CFR 第 11 部分)的要求。該法規對使用電子文件代替紙質文件做出了規定。

 

21 CFR 第 11 部分合規性包括規程要求和技術要求。

· 規程要求是最終用戶機構所制定的標準操作程序。

· 技術要求是所使用的合規性管理軟件的功能特征。

僅滿足技術要求并不能保證 21 CFR 第 11 部分合規性。合規性由機構的工作流程和所用系統兩者決定。

 

軟件的功能包括限制未經授權的用戶、密碼策略和失效日期、定義的用戶權限和角色、通過審計日志、審計報告以及機載電子簽名工作流程跟蹤所有數據更改。購買 Countess SAE 軟件許可證后,所有 Countess 3 和 Countess 3 FL 全自動細胞計數儀都可以在 SAE 模式下運行。要實現 21 CFR 第 11 部分合規性,機構還需要以合規方式制定和記錄標準操作程序。

 

 

 

 

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賽默飛世爾科技(中國)有限公司

 


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