心臟血管化類器官（cVOs）和肝臟血管化類器官（hVOs）的培養步驟，包括細胞準備、微圖案化、分化誘導、生長因子和小分子的添加以及后續的培養和分析。

第一，心臟血管化類器官（cVOs）培養步驟

1. 細胞準備

- 使用人類多能干細胞（hPSCs），包括人類胚胎干細胞（hESCs）和誘導多能干細胞（hiPSCs）。

- 維持hPSCs在Essential 8（E8）培養基中，每3-4天傳代一次。

2. 微圖案化

- 使用硅膠模具（stencil）在多孔板中創建2-6毫米直徑的圓形hPSC單層微圖案。

- 將模具放置在孔板中，用Matrigel（1:100稀釋）覆蓋模具，凝固后移除模具，留下微圖案化的hPSCs。

3. 分化誘導

- 第0天：添加4或5 μM CHIR（GSK3β抑制劑）和5 ng/ml FGF2。

- 第3天：添加5 μM IWR（Wnt信號通路抑制劑）。

- 第5天：開始添加血管誘導因子，包括50 ng/ml VEGF（血管內皮生長因子）。

- 第7天：繼續添加5 ng/ml FGF2、10 μM SB（TGF-β信號通路抑制劑）、50 ng/ml ANG2（血管生成素2）。

- 第9天：添加50 ng/ml ANG1（血管生成素1）。

- 第11天：繼續添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB（血小板衍生生長因子）。

- 第13天：添加2 ng/ml TGF-β1（轉化生長因子β1）。

- 第15天：繼續添加5 ng/ml FGF2、10 ng/ml PDGF-BB、2 ng/ml TGF-β1。

4. 培養和分析

- 在分化過程中，使用時間序列成像技術（如Incucyte S3）監測細胞的形態變化。

- 使用共聚焦顯微鏡進行高分辨率成像，以觀察細胞類型和血管結構。

- 通過單細胞轉錄組學（scRNA-seq）分析細胞類型和基因表達。

- 進行電生理學（如多電極陣列MEA和電極記錄）和鈣成像分析，以評估cVOs的功能特性。

第二， 肝臟血管化類器官（hVOs）培養步驟

1. 細胞準備：使用與cVOs相同的hPSCs。

2. 微圖案化：同樣使用硅膠模具在多孔板中創建2毫米直徑的圓形hPSC單層微圖案。

3. 分化誘導

- 第0天：添加100 ng/ml Activin-A、10 ng/ml BMP-4、3 μM CHIR、100 ng/ml FGF2和10 μM LY294002（PI3K-AKT抑制劑）。

- 第3天：添加50 ng/ml FGF-10。

- 第6天：添加10 ng/ml FGF10和10 ng/ml BMP-4。

- 第3天或第6天：開始添加血管誘導因子，包括50 ng/ml VEGF、5 ng/ml FGF2、10 μM SB、50 ng/ml ANG2、50 ng/ml ANG1。

- 第7天至第20天：繼續添加上述血管誘導因子，并根據需要調整生長因子和小分子的濃度。

4. 培養和分析

- 使用與cVOs相同的成像技術和分析方法來觀察hVOs的形態和功能。

- 通過免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡成像，確認肝臟細胞（HCs）、內皮細胞（ECs）和平滑肌細胞（SMCs）的存在和整合。

- 通過單細胞轉錄組學分析hVOs的細胞類型和基因表達。

通過這些詳細的步驟，研究人員成功地在體外模擬了人類心臟和肝臟的早期血管化過程，為研究心血管和肝臟疾病提供了新的模型和工具。

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