百歐博偉生物：菌種在傳代過程中，因遺傳物質發生變異而引起的原有的優良性狀漸漸消失或變壞，出現長勢差、發酵效價不高、質量不好、菌落叢生等現象。這些現象人們泛稱為“退化”。 菌種退化是一個漸變的過程，發生有害變異的個體在群體中顯著增多以至占據優勢時才會顯露出來。因此盡管個體的變異可能是一個瞬時的過程，但菌種呈現“退化”卻需要較長的時間。菌種退化的本質是染色體的變異，自然界中生物體發生變異是的，如果這種變異朝著人們認為是壞的方向發展，就會造成退化。菌種的整體性能，在不因外界因素而逐漸變差，且會遺傳給下一代，就稱為菌株退化。

需要注意的是，退化和老化是兩個截然不同的概念。菌種培育過程中隨著菌齡的增加，養分不斷消耗，菌種必然會出現老化現象。菌體老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，細胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌種接入培養基后表現為菌絲生長慢、抵抗雜菌能力弱、產酶能力下降等。老化現象不會傳給子代，這是與退化的區別。所以，一旦菌株出現了異常現象，首先要分清是老化還是退化，或是單純因為外界培養條件發生變化而引起。如果是因老化或外界條件變化引起的異常, 采用新的培養基及適合的培養條件后菌株生長會恢復原狀；如果是因退化而引起，則不會改變生長的惡劣狀況，這時就要對菌株進行復壯。本文將對菌種退化的原因加以簡析，并給出相應有效的預防措施及復壯技術。

一、退化原因

1、有害突變及細胞遺傳學原因

根據細胞生物學觀點，細胞變異和分裂速度密切相關，分裂速度越快，變異將會越多。微生物由于分裂速度很快，分裂中的變異數量將會增加，而菌種退化與細胞變異密切相關。據有關數據統計，通常每三百個細胞中，就會出現一個變異。在多代傳代繁殖中，變異概率將會更高。當菌種遺傳物質發生變異之后，突變體往往更能適應外界環境條件，變異的細胞再分裂，變異體將會越來越多，直到最后代謝能力退化。

2、生理代謝方面的原因

菌種制備時，菌體培養在特定的培養基上，這些培養基通常具備菌種生長、發育及繁殖所需的營養物質，如蛋白質、糖類、生長因子及水等。但是，由于各種營養物質的配比不一定，即使一個優良的菌株，如果長期使用基本相同的培養基，其營養不能達到生理要求，長此以往培育下去，必然造成營養不良。除了培養成分配比之外，培養環境也是重要方面，如果對其控制不當，將會嚴重影響菌種的生長繁殖。比如微生物培養時，通常會分泌多種胞外酶，如纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶等，以分解有機物進而獲得營養及能量，當培養條件不適合時，這些酶類分泌量會大幅度減少，導致營養物質無法利用，從而生長停止，如果這種情況長期發展下去，將會導致菌種退化。

3、保藏方式不當或長期保藏

目前國內外防止菌種退化的辦法是采用液態氮超低溫保藏。此外，菌種長期保存或長期使用后，菌絲長勢減弱，容易提前出現老化現象。一般的保藏方法，菌株雖在低溫下保藏，但并未停止其生命活動，仍然存在著變異的可能。

4、菌種混雜

在菌種繼代培養過程中，不同品種間交叉感染，導致不同品種的菌絲體混雜在一起，造成原有品種生產性狀的改變，常常表現出產量下降、質量變劣等退化現象。

5、宿主（感受態）老化

對于基因工程菌來說，菌種退化是一個無法回避的問題，也是影響正常發酵生產的障礙。其具體表現形式一般為發酵早期溶菌、菌體生長緩慢、糖代謝異常、發酵OD低以及酶活（效價）差等，嚴重影響了發酵批次的穩定性。對于工程大腸桿菌來說，其異常表現與污染噬菌體有類似之處，判斷起來有一定的迷惑性。而究其原因，大多數情況是由于宿主感受態自身發生老化或退化引起。這種情況下，即使更換發酵設備或者對發酵環境全面凈化處理也無濟于事。

二、菌種退化的預防及其復壯措施

1、定期分離菌種,以達到純化效果

在菌種培養中，為了保證菌種質量，每隔1至2年，必須對原菌種進行分離。菌種純化是常用的一種復壯方法。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離剔除，挑選出具有優良性狀的菌株在適宜的培養基上培養，恢復菌種原有的生長狀態，再進行擴大培養。

2、控制菌種傳代次數

由于菌種退化和傳代次數密切相關，應在培養中給予重視，一般情況下，代數不能超過5代。菌種在多次傳代過程中會發生少量基因的突變，到突變達到一定程度時，就會造成遺傳物質的改變，然而頻繁傳代一般都是負變異占優勢。因此，控制菌種的傳代次數也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

3、采用適宜的保藏方法

建議采用液氮超低溫保藏，液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在超低溫液氮中。常用的保護劑有甘油、血清蛋白、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環、糊精、吐溫80等，不同的菌種要根據自己的特性選擇不同的保護劑。在超低溫環境中菌種幾乎喪失了代謝功能，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低，這種方法對大部分菌株都適用，且保存時間長達數年。具體操作方法：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（ 在塑料瓶的底部放一塊重物，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細繩并作記號，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后，把安瓿管浸入液氮中進行長期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時， 應先將安瓿管置于35~40℃的溫水中，使瓶內的冰塊迅速融解，然后在無菌條件下開啟安瓿管，用接種針取菌塊移接于適宜的培養基上活化培養。

4、菌絲分離

挑取健壯菌絲體頂端部分進行純化培養，以保持菌種的純度，使菌種恢復原來的生活力和優良種性，達到復壯的目的。

5、適當更換培養基

長期在同一培養基上繼代培養的菌種，活力可能逐漸下降。在菌種保藏傳代中，經常改變培養基成分，或在原有的培養基中添加酵母膏、麥芽汁、氨基酸類物質和維生素等，以刺激菌絲生長，提高菌種活力。

6、更新原始宿主菌

工程菌出現菌種退化問題后，技術人員常用的對策是重新轉化保種，誤以為這樣可以解決問題，這種做法對有些退化情況或者短期內可能有一定效果，但其實并不能解決問題，類似發酵異常問題往往還是周而復始反復出現。需要明白的是，宿主本身也是菌種，也存在老化退化問題，只有更換原始出發宿主菌，并更新其相應感受態，然后再轉化保種，才有可能頑疾。

三、酵母菌純化復壯流程舉例

1、菌種活化：將酵母菌種接種在5 % YPD 固體斜面上，30 ℃恒溫培養1 d，重復2 次。用滅菌牙簽挑取適量活化的酵母菌斑接種于5 mL 液體YPD 培養基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養12～16 h，此時可達到對數生長期。

2、初篩：取上述活化菌液100 μL，置于5 mL PDA 培養基3 種不同的液體培養基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養12～16 h，分別稀釋為10 萬倍和100 萬倍2 個濃度梯度，取50 μL 稀釋液涂布到相應的固體PDA 培養基平皿中，30 ℃恒溫培養2 d，觀察并記錄菌落生長情況。

3、復篩：挑出光滑圓潤、色澤乳白、形狀規則且較大的菌斑，用牙簽挑取少許置于5 mL PDA液體培養基中，30 ℃ 200 r/min 搖培過夜。取1.5 mL 菌液3500 r/min 離心5 min 得菌體，加入1 mL PDA液體培養基重懸，山梨醇、甘油處理過夜。取1 mL 處理后的菌液離心得菌體，分別加入1 mLPDA液體培養基重懸，稀釋10 萬倍后涂布在固體PDA培養基上，30 ℃恒溫培養，3 d后觀察記錄。

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