Aortic Stress Activates an Adaptive Program in Thoracic Aortic Smooth Muscle Cells That Maintains Aortic Strength and Protects Against Aneurysm and Dissection in Mice

Keywords: aortic aneurysm; extracellular matrix; homeostasis; mechanical stress; smooth muscle cell.

主動脈壁暴露在不斷變化的環境中。在壓力增加的情況下，如血流動力學壓力，主動脈壁感應機械信號發生重塑，并增加其厚度以保持主動脈強度和承受壓力。這種適應性反應由多種細胞類型協調，特別是主動脈平滑肌細胞（SMCs），它們接收機械信號并激活信號傳導和基因表達以增加主動脈壁強度。各種遺傳缺陷和環境風險因素可能會損害這種適應性反應，導致主動脈衰竭、主動脈瘤和急性主動脈夾層（AAD）發展，并最終導致破裂。然而，這種適應性反應的分子和細胞過程及其調控尚不清楚。

鑒于此，美國貝勒醫學院心臟外科及肯塔基大學列克星敦分校生理學系團隊在一項研究中對高脂肪飲食（HFD）和血管緊張素II（AngII）輸注野生型小鼠誘導的散發性AAD小鼠模型的主動脈進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq）和單細胞轉座酶可及染色質測序（scATAC-seq）分析，觀察到 AngII 輸注誘導內側厚度增加，這與胸主動脈 SMC 群體中的適應性基因表達程序有關，且Yes 相關蛋白（YAP）被確定為驅動這種適應性反應的關鍵轉錄因子（TF），對于維持主動脈穩態、預防動脈瘤和夾層的發展至關重要。研究成果發表于 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“Aortic Stress Activates an Adaptive Program in Thoracic Aortic Smooth Muscle Cells That Maintains Aortic Strength and Protects Against Aneurysm and Dissection in Mice”。

首先，研究了飼喂高脂飲食并輸注 AngII（2000 ng/kg/min；AngII/HFD）的 WT 小鼠的適應性反應。研究表明，在 C57BL/6J WT 小鼠中，AngII/HFD 可誘導胸主動脈段和腹主動脈段的主動脈退行性變，出現主動脈擴張、AAD（包括主動脈瘤、夾層和破裂）、重度 AAD（包括夾層和破裂）和破裂。同時，主動脈內側厚度和SMC 增殖顯著增加。然后，檢查了響應 AngII 輸注的 SMCs 基因表達譜的變化，發現 AngII/HFD 處理的 WT 小鼠的 SMCs 中參與傷口愈合、彈性纖維組裝、ECM 組織、肌動蛋白細胞骨架組織和細胞-基質-黏著斑的基因表達增加，多種信號通路，如 P13K-Akt 和轉化生長因子TGF-β也上調。差異表達基因（DEG）分析表明，AngII/HFD  增加了與增殖、膠原蛋白生成、彈性纖維組織、細胞基質連接、細胞遷移、細胞存活、抗氧化劑、DNA 損傷修復、生長因子分泌和 TGF-β信號等相關的適應性反應基因的 mRNA 豐度。這些數據表明，主動脈暴露于 AngII/HFD 會觸發參與 SMC 功能和 ECM 重塑的基因集的系統性誘導，這可能對維持主動脈壁強度和主動脈壓力升高很重要。

為了了解響應主動脈應激的基因表達的控制，進行 scATAC-seq 分析以檢查 AngII/HFD 處理的小鼠和鹽水/CD 對照處理的小鼠的主動脈 SMCs 中適應性反應基因的染色質可及性。根據基因活性譜的相似性，總共鑒定了 18 個簇（圖1 A），這些簇的身份是根據細胞標記基因的染色質可及性/基因活性確定的（圖1 B），其中有 3 個 SMC 簇顯示出 SMC 特異性基因活性。

通過GO分析和差異激活基因（DAG）分析比較鹽水/CD 處理和 AngII/HFD 處理小鼠 SMCs 中基因活性譜（圖1 C、D），發現 AngII/HFD 處理小鼠的 SMCs 中細胞因子產生和炎癥反應的基因活性增加。與其基因表達譜一致，AngII/HFD 處理小鼠的 SMC 在傷口愈合、血管生成、增殖、ECM 組織、肌動蛋白細胞骨架組織、細胞遷移、氧化應激反應和 TGF-β 信號中也表現出基因活性富集。這些數據表明，通過增加基因調控區域的染色質可及性，主動脈暴露于 AngII/HFD 會誘導適應性基因表達。

圖1    scATAC-seq分析顯示，主動脈應激觸發平滑肌細胞（SMCs）染色質可及性動力學。

接下來，為了了解適應性反應的調節，嘗試確定參與適應性基因誘導的轉錄因子（TFs），發現轉錄增強相關結構域蛋白（TEAD）家族成員是與適應性基因活性強烈正相關的基序活性轉錄因子。TEADs 是 YAP 的轉錄伙伴，YAP 是感知機械信號和促進細胞增殖和器官發育的關鍵信號分子。為了了解 YAP/TEADs 在 AngII 輸注期間 SMC 基因表達中的更廣泛作用，檢查了包含 TEAD 基序的 YAP/TEAD 靶標的染色質可及性。與對照處理小鼠的 SMC 相比，2383 個基因在 AngII/HFD 處理小鼠的 SMCs 中顯示出豐富的染色質可及性/基因活性，這些基因與肌肉細胞增殖、肌動蛋白絲組織和 ECM 組織有關，并在 Wnt、TGF-β 和 PI3K-Akt 信號通路富集。這些數據支持，YAP/TEADs 在 SMCs 響應 AngII/HFD 中增強適應性基因的染色質可及性/基因活性方面的潛在作用。然后，研究了彈性纖維中維持主動脈壁完整性的關鍵成分——賴氨酰氧化酶（LOX），發現 AngII/HFD 處理的小鼠 SMCs 中 Lox 表達和基因活性顯著增加，這些數據表明，YAP/TEAD 可能與適應性基因的調控區域結合并參與這些基因的組成型和誘導型表達。

為了進一步確定 YAP 在 SMCs 中響應機械應力的直接作用，施加循環拉伸應力以檢查 YAP 的激活及其對 SMC 基因表達的影響，這模擬了血壓對主動脈細胞產生的機械力。人胸主動脈 SMCs 經歷循環拉伸（10%，1 Hz） 24 小時，發現其顯著增加了 EdU標記的增殖 SMCs 的百分比（圖2 A）和膠原蛋白I、膠原蛋白 III、彈性蛋白和 LOX（前 LOX 和活性 LOX）的產生（圖2 B）。

循環拉伸還增加了 YAP 表達、YAP 去磷酸化/激活（圖2 B、C）和 YAP 細胞核易位（圖2 D）。重要的是，WT YAP 或組成型活性 YAP 的過表達誘導細胞增殖（圖2 E）和 LOX、彈性蛋白、膠原蛋白I 和膠原蛋白 III 的產生（圖2 F）。相反，刪除 YAP 阻止了循環拉伸誘導的 LOX 蛋白豐度和切割（圖2 G）和 Lox mRNA（圖2 H）的增加。

為了確定 YAP 在 SMCs 中的直接靶點，檢查循環拉伸對 YAP 與靶點結合的影響，進行了基于 YAP 的 ChIP-seq 分析，發現在拉伸的 SMCs 中共有 581 個結合位點/基序富集，并確定了一組新的 YAP 靶點，如 ECM 相關基因（Col12a1、Fn1、Lox、Mfap5 和 Fstl1）、血管生成相關基因（Tnfrsf12a、Jag1、Notch2 和 Srpx2）、細胞遷移基因 （Enah 和 Anln）、生長因子基因 Igfbp2 和 TGF-β 信號轉導基因（Smad2 和 Rasl11b）。

這些研究結果表明，YAP 與適應性基因（例如 LOX）的調控區域結合，并誘導它們在周期性拉伸下的表達，YAP 在感知機械信號和誘導 SMCs 中的 ECM 產生和細胞增殖方面起著關鍵作用。

圖2    YAP 響應循環拉伸在促進平滑肌細胞（SMC）增殖和細胞外基質（ECM）基因表達中的關鍵作用。

為進一步確定 YAP 在主動脈應激期間 SMC 適應性基因表達中的作用，對 SMC 特異性 Yap 缺失小鼠的升主動脈進行了 scRNA-seq 分析，比較了 SMC-Yap+/+ 和 SMC-Yap-/- 小鼠之間的基因表達譜。GO 和 KEGG 分析結果表明，SMC-Yap+/+ 小鼠中輸注 AngII 增加了在傷口愈合、SMC 增殖、遷移、ECM 產生/組織、細胞-基質粘附/黏著斑以及細胞對 TGF-β 刺激的反應中發揮作用的基因的 mRNA 豐度。然而，這種上調在 AngII 注入的 SMC-Yap-/- 小鼠中受到損害。進一步的 DEG 分析還表明，AngII 輸注誘導了 SMC-Yap+/+ 小鼠中適應性反應基因的表達，并且這種誘導在 SMC-Yap-/- 小鼠中被削弱，這支持 YAP 在促進適應性反應中基因表達中的作用。注入 AngII 的 SMC-Yap+/+ 小鼠YAP 表達增加、p-YAP/總 YAP 比率降低以及 YAP 核易位增加，說明 AngII 輸注誘導 YAP 激活。與注入 AngII 的SMC-Yap+/+ 小鼠相比，SMC-Yap-/- 小鼠顯示 SMC 增殖、中層厚度和 ECM 蛋白（彈性蛋白、LOX、膠原蛋白 I 和膠原蛋白 III）的產生顯著降低，但 SMC 細胞凋亡增加。這些發現支持，YAP 在促進主動脈應力下的適應性反應中的關鍵作用。

最后，通過比較輸注 AngII（1000 ng/kg/min）的 SMC-Yap-/- 和 SMC-Yap+/+ 小鼠的疾病發展評估 SMC YAP 在主動脈保護中的作用。與注入 AngII 的 SMC-Yap+/+ 小鼠相比，SMC-Yap-/- 小鼠顯示主動脈變性/破壞顯著增加（圖3 A），大多數主動脈段的主動脈擴張（圖3 B），擴張發生率增加、AAD（包括所有動脈瘤、夾層和破裂）和重度 AAD （包括夾層和破裂）情況加劇（圖3 C）。在 AngII 輸注的 SMC-Yap-/- 小鼠中觀察到的 AAD 和嚴重 AAD 的發生率增加，尤其是在升主動脈、主動脈弓和腎上主動脈中觀察到。

此外，還檢查了 SMC-Yap-/- 小鼠和 SMC-Yap+/+ 小鼠主動脈的收縮功能。在沒有 AngII 輸注的情況下，與 SMC-Yap+/+ 小鼠相比，SMC-Yap-/- 小鼠的收縮功能顯著受損。AngII 輸注（1000 ng/kg/min，持續 7 天）降低了 SMC-Yap+/+ 小鼠的收縮性，且在 SMC-Yap-/- 小鼠中進一步降低（圖3 H），表明 Yap 的丟失在有或沒有 AngII 輸注的兩種情況下都會導致收縮功能障礙。這些發現支持，SMC YAP 在主動脈應力下維持主動脈結構和功能完整性方面起關鍵作用。

圖3     平滑肌細胞（SMC）特異性 YAP 在主動脈壁中的保護作用。

圖4   圖形概要

總之，該研究表明，主動脈應力在 SMCs 中誘導表觀遺傳程序，促進維持主動脈穩態的適應性反應。YAP 通過感應機械信號和誘導適應性基因表達，在這種適應性反應中起著核心作用。適應性反應受損可能代表主動脈疾病發展的重要機制。

參考文獻：Zhang C, Li Y, Chakraborty A, Li Y, Rebello KR, Ren P, Luo W, Zhang L, Lu HS, Cassis LA, Coselli JS, Daugherty A, LeMaire SA, Shen YH. Aortic Stress Activates an Adaptive Program in Thoracic Aortic Smooth Muscle Cells That Maintains Aortic Strength and Protects Against Aneurysm and Dissection in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Feb;43(2):234-252. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318135. Epub 2022 Dec 29. PMID: 36579645; PMCID: PMC9877188.

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