胃腸道運動障礙是一類常見的疾病，包括食管失弛緩癥、胃輕癱、腸假性梗阻和慢性便秘等。這些疾病通常與腸道神經系統（ENS）中抑制性NO產生運動神經元的功能障礙有關。由于缺乏有效的治療方法，這些疾病對患者的生活質量造成了嚴重影響。

利用hPSCs開發一個能夠模擬人類ENS的體外模型，包括二維（2D）ENS培養和三維（3D）神經節類器官。這些模型不僅能夠模擬ENS的發育過程，還能用于藥物篩選和再生醫學應用。通過單細胞RNA測序技術，詳細分析NO神經元的分子特征，并通過高通量小分子篩選，發現了能夠調節NO神經元活性的藥物。

Kirkstall Quasi Vivo®類器官串聯芯片3D動態培養系統

（一）構建能夠模擬人類腸神經系統發育和功能的3D腸神經節類器官模型。這些模型不僅能夠用于研究腸神經系統的發育機制，還可以用于藥物篩選和再生醫學研究。

1. hPSCs的培養和維持

- 使用hESC（人類胚胎干細胞）系H9（WA09-WiCell）或iPSC（誘導多能干細胞）系WTC-11。

- hPSCs在Geltrex包被的培養皿中培養，使用E8培養基進行維持。

- 每30天檢測一次支原體污染。

2. ENCC（腸神經嵴細胞）的誘導

- 當hPSCs單層培養達到約70%匯合時，開始12天的ENCC誘導方案。

- 第0天：吸去E8培養基，替換為神經嵴誘導培養基A（含有BMP4、SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養基）。

- 第2天和第4天：使用神經嵴誘導培養基B（含有SB431542和CHIR 99021的Essential 6培養基）。

- 第6天、第8天和第10天：使用培養基C（培養基B中加入視黃酸）。

- 第12天：吸去培養基C，用Accutase處理ENCC單層細胞（30分鐘，37°C，5% CO?），離心后將ENCC重懸于NC-C培養基（含有FGF2、CHIR 99021、N2補充劑、B27補充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養基）中，轉移到超低吸附板中形成自由懸浮的3D腸神經嵴球體（enteric crestospheres）。

3. 腸神經元的誘導

- 第15天：將腸神經嵴球體聚集到孔中心，移除NC-C培養基，根據最終培養布局（2D ENS培養或3D腸神經節類器官）進行不同處理。

- 對于3D腸神經節類器官：

- 避免使用Accutase處理，直接向腸神經嵴球體中加入相同體積的腸神經元培養基（含有GDNF、抗壞血酸、N2補充劑、B27補充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養基）。

- 每隔一天更換一次腸神經元培養基，直到第30-40天，之后可以減少更換頻率，但需增加更換培養基的量。

4. 3D腸神經節類器官的培養和維護

- 在第15天之后，腸神經嵴球體在腸神經元培養基中繼續培養，逐漸分化為腸神經節類器官。

- 培養過程中，每隔一天更換一次培養基，直到第30-40天。

- 從第40天開始，可以減少更換培養基的頻率，但需增加每次更換的培養基量，以維持類器官的長期培養。

5. 功能驗證和分析

- 免疫熒光染色：用于檢測神經元和膠質細胞標記物的表達，驗證類器官中不同細胞類型的形成。

- 單細胞RNA測序：用于分析類器官中細胞類型的分子特征，鑒定NO神經元等特定亞型。

- 鈣成像和電生理記錄：用于評估神經元的活性和功能成熟度。

- 藥物篩選和功能測試：通過高通量篩選，鑒定能夠調節NO神經元活性的化合物，并在體外和體內模型中驗證其功能。

（二）在進行類器官傳代時，需要注意以下幾個關鍵事項

1. 傳代前的準備

- 培養基準備：確保使用適合類器官生長的培養基，如含有特定生長因子和信號分子的培養基。對于腸類器官，可以使用成熟商業化類器官生長培養基。

- 基質準備：使用適合的細胞外基質材料，如Matrigel，以支持類器官的三維結構。

- 工具和材料準備：準備好所有需要的工具和材料，如溫和細胞解離試劑、離心管、移液槍頭等，并確保它們處于適當溫度（如4°C或室溫）。

2. 類器官的處理

- 觀察和評估：在顯微鏡下觀察類器官，確保其健康狀態良好。

- 溫和解離：使用溫和的細胞解離試劑（如TrypLE或Gentle Cell Dissociation Reagent）來解離類器官，避免對細胞造成損傷。

- 避免過度解離：解離時間不宜過長，以免損傷細胞。對于小鼠腸類器官，室溫下孵育1分鐘即可。

3. 離心和重懸

- 離心條件：以適當的離心力（如290×g，4°C，5分鐘）離心，以收集類器官。

- 重懸：使用預冷的培養基或基質重懸類器官，避免產生氣泡。

4. 接種和培養

- 基質和類器官混合：將類器官與Matrigel等基質混合后，快速接種到培養板中，形成凝固的dome。

- 培養條件：確保培養板在37°C、5% CO?的條件下培養，以促進Matrigel的凝固和類器官的生長。

- 避免直接接觸：加入培養基時，應避免直接沖擊dome，以免破壞其結構。

5. 培養后的維護

- 定期換液：每周進行三次換液，以維持類器官的生長。

- 監控生長：定期觀察類器官的生長情況，確保其健康和正常發育。

- 傳代比例：根據類器官的生長速度，選擇合適的傳代比例（如1:2至1:6）。

6. 其他注意事項

- 傳代頻率：根據類器官的生長情況，定期進行傳代，通常每7至10天進行一次。

- 冷凍保存：在長期培養過程中，可以將類器官進行冷凍保存，以便后續使用。

- 基因穩定性：長時間傳代可能導致類器官的基因穩定性發生變化，因此需要定期進行基因檢測。

（三）展望：結合Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯芯片動態培養構建系統，確保3D腸-腦類器官的長期培養

1. 優化培養基和灌流條件

- 培養基成分：使用適合腸神經節類器官的培養基，如含有GDNF、抗壞血酸、N2補充劑、B27補充劑、Glutagro和MEM NEAAs的Neurobasal培養基。此外，可以參考其他研究中使用的培養基成分，如添加RSPO1、EGF、PGE2等，這些成分對于維持腸干細胞的增殖和功能至關重要。

- 灌流參數：通過Kirkstall Quasi Vivo系統 精確控制灌流參數，如流速、流量等，確保類器官之間的物質交換和信號傳遞接近體內真實生理狀態。

2. 模擬體內微環境

- 細胞外基質（ECM）：使用適合的基質材料，如Matrigel，來模擬體內細胞外基質環境。Matrigel是一種常用的基質，能夠提供必要的細胞外基質蛋白，支持類器官的三維結構和功能。

- 動態灌流：利用Kirkstall Quasi Vivo系統的動態灌流功能，模擬體內血液循環和組織間液流動，為類器官提供持續的營養供應和廢物清除。

3. 定期傳代和監測

- 傳代頻率：根據類器官的生長情況，定期進行傳代，通常每7天進行一次。傳代時，可以使用溫和的細胞解離試劑，如TrypLE，將類器官分解成較小的片段或單細胞，然后重新嵌入到新鮮的基質中。

- 監測和評估：定期監測類器官的形態、細胞活性和功能。可以使用鈣黃綠素和碘化丙啶雙染等方法檢測細胞活性。此外，通過免疫熒光染色和單細胞RNA測序等技術，評估類器官中不同細胞類型的形成和功能。

4. 利用微流控技術促進細胞間相互作用

- 細胞間信號傳遞：通過Kirkstall Quasi Vivo系統的微流控通道，連接不同的類器官模塊，模擬體內細胞間的信號傳遞。例如，可以將腸神經節類器官與腸道類器官連接，研究神經信號對腸道功能的調控。

- 模擬生理剪切應力：利用微流控設備產生的剪切應力，模擬體內腸道的機械運動，促進類器官的功能成熟。

5. 長期培養的優化

- 冷凍保存：在長期培養過程中，可以將類器官進行冷凍保存，以便后續使用。這有助于保持類器官的基因穩定性和功能特性。

- 基因編輯和標記：利用基因編輯技術（如CRISPR-Cas9）對類器官進行標記或功能改造，以便更好地研究其在長期培養中的變化。

北 京 基 爾 比 生 物 科 技公司 主 營 產 品：

Kilby 全自動 3D-clinostat 細胞培養儀，

Kilby Gravity 微/超重力三維細胞培養系統，

3D回轉重力環境模擬系統，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall Quasi Vivo 類器官串聯芯片仿生系統