我國不孕及不育率逐年攀升，根據《柳葉刀中國婦幼健康特邀 重大報告》預測數據，2023年我國不孕率18.2% ，預計2025年將接近20%。不孕及不育率的快速上升意味著輔助生殖服務潛在需求人數 增長，從而驅動輔助生殖市場擴容。輔助生殖（ART）由三種手段組成：人工授精、配子移植技術、體外受精-胚胎移植（IVF-EF）。其中體外受精-胚胎移植即試管嬰兒，是指將不孕夫婦的卵子和精子通過人工方式取出，在體外培育受精并完成早期胚胎發育后，再移植回母體子宮內實現妊娠。

圖1.輔助生殖診療過程（來源：艾瑞咨詢）

中國每年新增出生缺陷兒約90萬例，其中單基因遺傳病占比高達22.2%。隨著基因檢測技術的突破，PGT（胚胎植入前遺傳學檢測）技術為這些家庭提供了從源頭阻斷遺傳病的新選擇。迄今為止，全球已經有數萬例家庭通過試管技術助孕，順利圓夢→獲得健康寶寶!誠然一個個試管寶貝的誕生也見證了輔助生殖技術從無到有，從有到優的過程；該技術的不斷更新升級更幫助人們有效解決“生不出”難題，且致力于化解“生不好”的困擾。

第三代試管嬰兒即胚胎植入前遺傳學篩查診斷技術(PGS/PGD)，主要是對胚胎的遺傳物質進行檢測。PGS即胚胎植入前遺傳學篩查，是對胚胎的染色體數目和結構進行檢測，分析對比是否有重復、缺失或易位等異常情況；PGD即胚胎植入前遺傳學診斷，是對染色體上的基因進行檢測，診斷胚胎有沒有攜帶導致某種特定疾病的基因突變。

根據世界衛生組織的定義，PGD\PGS有了新的命名，統一稱PGT，包括PGT-A,PGT-M,PGT-SR；PGT技術通過在體外受精后對胚胎進行基因檢測，篩選出無遺傳缺陷的胚胎進行移植，將遺傳病防控從產前診斷提前至胚胎階段。這一技術被譽為“第三代試管嬰兒”。

圖2.PGT的工作流程

表1.PGT的分類

利用單細胞擴增技術和NGS技術對輔助生殖過程中體外培養的卵裂期或囊胚期胚胎進行檢測，既單細胞測序全基因組擴增（WGA），該技術可檢測全部的23對染色體非整倍體、≥4Mb的染色體片段缺失和重復、≥10Mb且比例≥30%的嵌合和夫婦一方或雙方已知1-4 Mb遺傳型CNVs。測序數據量1-2 M左右。

目前存在的主要三種擴增方法有：簡并寡核苷酸引物PCR擴增（DOP-PCR）、多重置換擴增（MDA）、多次退火環狀循環擴增（MALBAC），三種方法各有優缺點。

表2.單細胞擴增技術的三種方法對比

采用隨機引物或者部分隨機引物，通過熱循環實現指數擴增，具體來說DOC-PCR（Degenerate Oligonucleotide Primed PCR），即退化寡核苷酸引物PCR，是隨機擴增得到全基因組序列的；這不同于一般的PCR，一般的PCR只能擴增特定的DNA片段。該技術需要使用簡并配對引物，即類脫氧肌苷引物，它可以結合到DNA任何部位。引物的3’端為6bp退化寡核苷酸，5’端為正常的堿基。3’端和DNA鏈隨機結合，最初幾個循環退火溫度要低（30℃左右），然后延伸直到5’端引物配對處。但該技術容易造成堿基對突變、短串聯重復( short tandem repeat，STR)增加或減少。

圖3.DOP-PCR原理

技術原理：擬線性的擴增過程降低了指數擴增的序列偏好性。擴增引物，5’含有27 bp的共同序列，3’是8 bp的隨機序列。利用特殊的隨機引物，使擴增產物能首尾互補形成環，進行近乎線性的全基因組預擴增，再通過PCR技術進行指數式擴增，從而降低擴增過程中錯誤累積。擴增偏好性可重復，適合CNV檢測；聚合酶保真性一般，不適合SNV檢測。

圖4.MALBAC原理圖

采用隨機6堿基引物，在恒溫條件下，由Phi29 DNA聚合酶引導，與模板DNA結合，進而置換模板的互補鏈，而后循環擴增。Phi29 DNA聚合酶相對傳統的DNA聚合酶具備更高的擴增效率和保真性。具體來說MDA擴增原理是使用隨機的六聚體引物和phi29DNA聚合酶進行反應，在恒溫條件下進行擴增。該聚合酶具有很強的鏈置換特性，可擴增產生50~200 kb的DNA片段，可用于構建大片段文庫，同時該酶還能以新合成的DNA子鏈為模板，繼續合成新的DNA子鏈，擴增產量高，同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，phi29 DNA聚合酶具有很高的復制保真性，準確性更高、基因組覆蓋度更高，適用于SNV分析。雖然產物產量高和擴增產物長度可達100 Kb左右，覆蓋度好，但是對樣本質量要求高且指數擴增的偏好性重復性不好，不適合CNV類檢測。

圖5.MDA單細胞基因組測序流程