免疫熒光概述

我們在細胞成像領域深耕近50年，可為您提供值得信賴的研究工具和方案，幫助您實驗即可獲取高品質(zhì)的細胞圖像。Invitrogen™成像試劑和抗體經(jīng)過廣泛驗證，享有認可度，且在已發(fā)表研究中被頻繁引用。

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無論您是剛開始進行細胞成像，或者已經(jīng)富有經(jīng)驗，都可使用以下經(jīng)過驗證的五步法流程，確保輕松獲取發(fā)表級細胞圖像。

五步法高品質(zhì)固定細胞成像

遵照如下5個步驟采集盡可能的固定細胞圖像，即使您第一次使用也可獲得可供發(fā)表的高品質(zhì)細胞圖像。

步驟一：細胞和組織樣品處理

準備熒光標記的細胞樣品

為實現(xiàn)最佳的圖像質(zhì)量，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記 – 首先將細胞結構、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內(nèi)部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，最大限度提高信噪比。

固定液將細胞結構鎖定。

透化作用可去除細胞膜脂質(zhì) - 使標記和檢測試劑能夠穿過膜孔到達細胞內(nèi)部。

蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合。

在固定和破膜之后，使用NucBlue活細胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型試劑對U2OS細胞進行染色。圖A采用傳統(tǒng)甲醇溶液方法固定，圖B則采用基于甲醛優(yōu)化配方的Image-iT固定/透化試劑盒固定。對比可發(fā)現(xiàn)，圖A中甲醇固定的方法可導致肌動蛋白細胞骨架斷裂和細胞破碎，而Image-iT 固定/透化試劑盒則可為絕大多數(shù)細胞類型提供最佳固定條件。

步驟二：標記樣品

使用細胞器特異性染料、探針和一抗檢測細胞結構和蛋白

通過不同顏色熒光標記不同的靶標，可以直觀的觀察同一樣品細胞內(nèi)不同結構和蛋白。熒光標記靶標的方法主要包括熒光染料、免疫標記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標記細胞內(nèi)的結構和蛋白，讓您在成像時更輕松地進行觀察。細胞生物學采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團。這些熒光基團經(jīng)過不同的方法修飾或結合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細胞器或蛋白結合。通過化學修飾，單個熒光基團可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。例如，發(fā)出綠色熒光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子經(jīng)過修飾后，可以靶向肌動蛋白微絲，可以結合IgG用于免疫標記，還可用作全細胞染料。Invitrogen提供了超過51000種高品質(zhì)一抗，其中的部分抗體可以直接結合大量明亮的熒光染料和標記物，包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。

免疫熒光標記推薦產(chǎn)品

Invitrogen提供了100,000多種高質(zhì)量的一抗，覆蓋85%以上的蛋白靶點。其中涵蓋一些抗體直標熒光標記物和標簽產(chǎn)品，包括Invitrogen的Alexa Fluor染料。

單個熒光基團可以進行任意數(shù)量的標記，包括用于標記細胞結構成分的功能化形式，例如（A）肌動蛋白、（B）微管蛋白和（C）Hydrazide全細胞標記。

采用Invitrogen Image-iT 固定/透化試劑盒制備染色用的培養(yǎng)細胞，然后采用Invitrogen BlockAid封閉液處理。先采用能識別線粒體的一抗標記樣品，然后與Alexa Fluor 750 染料標記的二抗 （紫色），Invitrogen NucBlue細胞核染料（藍色） 和Invitrogen ActinGreen 488即用型試劑（綠色）孵育。在Invitrogen EVOS FL全自動細胞成像系統(tǒng)上采集圖像。

步驟三：檢測樣品

優(yōu)化熒光信號，保證免疫熒光結果

檢測復雜的生物學結構需要最高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得最佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細調(diào)整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和最佳放大倍數(shù)。

固定和破膜HeLa細胞，采用Image-iT固定/透化試劑盒之中的試劑處理，與抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后將細胞與抗ATP 合成酶亞型 IF1 抗體一同孵育，并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 試劑盒（山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺）中的試劑進行標記。用NucBlue 可固定細胞即用型染料標記細胞核。采用共聚焦顯微鏡采集圖像。

中等至高豐度的蛋白靶標

二抗可用于間接檢測目的抗原。一抗與靶標直接結合，而二抗則以一抗為橋梁，間接結合目標生物分子。這種方法可以放大信號，提高靈敏度，最大限度的檢測出靶標。

一抗（橙色和黃色）與靶表位結合后，熒光標記的二抗（紫色和藍色）結合特異性的一抗。

中等至低豐度的蛋白靶標

鏈霉親和素結合物可以提高標記靶標的熒光基團的數(shù)量，從而放大信號?；阪溍褂H和素信號放大技術廣泛應用于熒光成像，用以提高一抗和二抗檢測的靈敏度。

使用熒光基團-鏈霉親和素標記的抗體可以增強信號，因為更多的熒光基團可以與單個抗體分子結合，從而放大信號。

低豐度蛋白靶標

對于傳統(tǒng)方法無法檢測到的低豐度蛋白靶標，酪胺信號放大技術(TSA)可以在不降低分辨率的前提下，進行靈敏的檢測。TSA技術采用了一種能在過氧化氫存在的條件下釋放活性染料的酶，從而使靶標明顯且清晰的與背景區(qū)分開。

酪胺信號放大技術在不影響分辨率的情況下獲取優(yōu)質(zhì)的靈敏度。

免疫熒光檢測推薦產(chǎn)品

與Alexa Fluor染料相比，Alexa Fluor Plus二抗采用專有的技術，信噪比高達4.2倍，為檢測低豐度靶標提供了更高的靈敏度。

Invitrogen Tyramide SuperBoost試劑盒采用 Invitrogen SuperBoost 技術，為低豐度蛋白靶標提供免疫熒光檢測方法。SuperBoost試劑盒的靈敏度是標準免疫化學（ICC）、免疫組織化學（IHC）和原位雜交（ISH）方法的10-200倍，可為低豐度靶標的高分辨成像提供優(yōu)質(zhì)的信號放大、定義和清晰度。SuperBoost試劑將Alexa Fluor染料的亮度與值得信賴的poly-HRP酪胺信號放大技術結合，使靈敏度比標準處理方法高2-10倍，包括其他供應商的試劑。

步驟四：保護樣品

避免熒光信號發(fā)生光漂白，提高免疫熒光圖像質(zhì)量

雖然熒光基團是進行高質(zhì)量細胞成像，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產(chǎn)生假性結果。抗淬滅封片劑可以保護熒光標記蛋白的穩(wěn)定性，維持數(shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。

推薦產(chǎn)品

Invitrogen ProLong Glass抗淬滅封片劑的設計旨在為整個可見和近紅外光譜內(nèi)提供抗淬滅保護。ProLong Glass封片劑的折射率為1.52，可與多種熒光染料一起用于幾乎所有細胞以及深度范圍為0.1 µm至150 µm的組織樣品，獲得明亮、高分辨率的Z-stack、3D和2D圖像。由于減少了圖像失真，其在油鏡和共聚焦顯微鏡下也能很好地工作。

ProLong抗淬滅封片劑用于固定細胞成像具有以下好處：

· 即使在長時間儲存后，仍可以在整個光譜范圍內(nèi)抑制光漂白

· 在整個光譜范圍內(nèi)的背景都很低

· 固化封片劑

· 可選含有或不含DAPI兩種形式

· 即用型隨取隨用優(yōu)化配方

· 可根據(jù)您的需求選擇折射率：ProLong Glass試劑為1.52，ProLong Diamond和ProLong Gold試劑為1.47

60秒延時成像顯示，使用ProLong抗淬滅封片劑能夠提高對光漂白的抵抗性。使用FITC鬼筆環(huán)肽標記固定的HeLa細胞，并使用ProLong Glass試劑、ProLong Diamond試劑、ProLong Gold試劑或50% PBS/甘油封片。在使用標準100瓦汞弧燈連續(xù)照明的條件下，使用20倍物鏡以12秒間隔采集圖像。

步驟五：樣品成像

保證您的免疫熒光結果具有分辨率和清晰度

通過采集最高清晰度圖像突破研究新發(fā)現(xiàn)。在當今激烈的科研競爭環(huán)境下，能否快速獲得可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像是決定您成敗的關鍵。想要獲取最頂級的圖像，就需要配備頂級成像元件的成像平臺，包括：

· 高性相機和光學元件，快速采集高分辨率圖像

· 全新一代LED光立方，擁有信噪比表現(xiàn)

· 功能強大的圖像采集和分析軟件，輕松采集發(fā)表級的圖像數(shù)據(jù)

免疫熒光成像推薦產(chǎn)品

選擇簡單易用的模塊化系統(tǒng)，可以根據(jù)您的實驗需求進行調(diào)整。我們提供可定制的20多種Invitrogen EVOS LED光立方、容器支架和物鏡等，涵蓋廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。

需要在提高樣品通量的同時獲取更多定量數(shù)據(jù)？Celllnsight CX5高內(nèi)涵篩選平臺提供自動圖像采集與同步數(shù)據(jù)分析，讓您在5分鐘內(nèi)分析多達50萬個表型細胞。

顯微鏡

高內(nèi)涵分析

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