手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
一直被模仿，從未被超越丨Agilent MHC 2D-LC /MS 液質聯用技術專題 2 - 多肽和寡核苷酸藥學研究
上期我們一同回顧了 Agilent MHC 2D-LC 發展歷史及深入的技術介紹，并分享了 MHC 2D-LC/6230 TOF 液質聯用系統在蛋白領域的應用成果，本期將聚焦于多肽（Peptide）和寡核苷酸（Oligo）藥學研究領域的應用。
圖 1. Agilent MHC 2D-LC/TOF 示意圖
在多肽和寡核苷酸的藥學研究工作中，有關物質分析鑒定和 QC 方法建立是行業共識的難題。由于雜質和 API 的性質極為相似，以及“差向肽”或寡核苷酸硫代造成的非對映異構體雜質等，單一的液相色譜方法往往會存在雜質和主峰共洗脫或者分離度低的問題，因此通常需要借助互補的檢測技術如 LC-UV-MS 聯用以及多個正交的液相色譜方法來進行有關物質的控制。主峰峰純度確認和雜質分析鑒定是 Peptide和Oligo 藥物 QC 工作的基礎。
HiRes 進行主峰純度確認
國家藥監局藥品審評中心發布的《化學合成多肽藥物藥學研究技術指導原則（試行）》1 中提出使用液質聯用方法對多肽主峰純度進行研究，以及使用正交方法進行有關物質分析。為了有效分離檢測到 0.1% 的低含量雜質，往往需要增大 API 進樣量（大于 0.5 mg/mL），這樣會造成主峰過載，從而大大降低雜質峰與主峰的分離度，造成無法對雜質峰進行準確定量或者質譜離子化抑制的問題。
解決辦法就是使用 HiRes 模式（圖 2）：將主峰連續切割為 10 片依次進入第二維色譜進行分析，相當于把主峰的濃度降低了 10 倍，解決了主峰“掩蓋”雜質峰的問題。如果在第二維應用正交方法，還可以將差向異構肽等有關物質實現分離和分別定量。
圖 2. 對目標峰的連續存儲的 HiRes 模式
ASM 進行一維質譜不兼容體系的雜質鑒定
與蛋白不同，Peptide 和 Oligo 一維分離時會用到有機溶劑或高鹽體系，當切割的組分含有機相或高鹽時，會在二維上保留變差甚至沒有保留，導致質譜信號降低；特別是 Oligo，當使用 2D-LC/MS 對 Oligo 陰離子交換分離（會用到高濃度 NaCl 或 NaClO4 質譜不兼容的鹽）的色譜峰進行質譜鑒定時，一維組分中的高濃度的鹽會影響 Oligo 在二維反相離子對的保留，在此推薦使用 ASM（圖 3）功能可降低二維上樣時的鹽濃度，保證一維組分能在二維上有保留進而實現質譜鑒定。
?
圖 3. ASM 管路為 1uL 的分流比 4:1
Agilent MHC 2D-LC/Q-TOF
大分子表征的應用案例-Peptide
MHC 應用案例
司美格魯肽雜質鑒定
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測器
反相分離，A 相：0.088M 磷酸二氫銨溶液（pH 3.6）：乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1），B相：乙腈
二維分離：Infinity II 1290 超高效液相色譜系統（二元），質譜兼容的反相體系
質譜：6545XT AdvanceBio Q-TOF
數據采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm 12.1
實驗結果
對司美格魯肽主峰前后的 10 個雜質進行質譜鑒定，其中 Cut6 的一級分子量比主成分多 106Da，結合文獻并使用 BioConfirm12.1 軟件自定義編輯修飾進行匹配，鑒定結果顯示該修飾發生在 25 位上的色氨酸（Trp）上（紅色方框所示）發生羥基芐基化修飾，其 y6 離子與主成分一致，而 y7、y8 以及 y9 等均比主成分多 106Da，進一步說明修飾發生在 25 位-Trp上。
圖 4. 司美格魯肽雜質鑒定的一級質譜圖以及雜質（25 色氨酸-羥基芐基化修飾）二級質譜匹配圖
HiRes MHC 應用案例
司美格魯肽主峰純度研究
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測器
反相分離，A 相：0.088M 磷酸二氫銨溶液（pH 3.6），乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1）；B相：乙腈
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統，質譜兼容的反相體系
質譜：6545XT AdvanceBio Q-TOF
數據采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結果
1 針進樣，使用 HiRes 對司美格魯肽主峰進行連續 10 片切割（從色譜峰的起始至結束）。該 10 片組分依次通過第二維色譜系統洗脫至質譜進行檢測。以 cut1 為例，cut1 中包含比主峰小 101Da 的雜質，通過解卷積后的質譜含量為 75%（主峰解卷積響應/（主峰解卷積響應+雜質解卷積響應））。綜合所有 10 個 cuts 的質譜數據，得出主峰的質譜純度為 99.72%。
圖 5. HiRes 應用案例 司美格魯肽主峰純度分析的色譜圖以及質譜純度結果
Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF
大分子表征的應用案例-Oligo
MHC 配備 ASM 應用案例
Oligo 陰離子交換色譜峰的質譜鑒定
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測器
離子交換分離，A 相：20mM Tris-HCl（pH 8.5），B 相：1M NaClO4 溶解在 A 相
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統，質譜兼容的反相體系，使用 ASM 功能降低上樣時的鹽濃度，保證 oligo 在二維反相離子對體系的保留，實現質譜鑒定
質譜：Agilent 6230 TOF
數據采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實驗結果
使用帶有 ASM 功能的 MHC 系統，1 針進樣對 Oligo 樣品主峰前后 9 個不同時間段進行鑒定，如圖所示 cut1 和 cut2 的解卷積后分子量差值為 535.1Da，可根據序列信息進一步推測雜質類型。
圖 6. Oligo 雜質分析的色譜結果以及部分解卷積結果
Agilent MHC 2D-LC /MS 系統將會不斷完善和創新，持續助力 Peptide 和 Oligo 等藥物研發進程。
1
獨特的 MHC 切割組件結合 Masshunter 軟件，在 MHC 模式下實現最多 11 個峰的智能存儲并通過二維洗脫并進行質譜鑒定，節約樣品，提高分析通量；
2
獨特的 MHC 切割組件結合 Masshunter 軟件，在 HiRes 模式對 Peptide 或 Oligo 等進行主峰純度評估，將包含在主峰中的雜質或通過二維分離開進行質譜鑒定或通過降低主峰的信號抑制而實現質譜鑒定；
3
MHC 組件中的 ASM 功能，可降低二維分離時的溶劑效應或鹽效應，保證目標峰在二維的保留，有助于提高質譜響應用于質譜鑒定。
參考文獻：
1. 國家藥監局藥審中心，化學合成多肽藥物藥學研究技術指導原則（試行），2023 年 2 月
相關產品
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心