在生物實(shí)驗(yàn)室中，瓊脂糖凝膠電泳是 DNA 和 RNA 基于片段大小進(jìn)行分離的常用方法。瓊脂糖凝膠基質(zhì)為多孔結(jié)構(gòu)，可用作核酸分子遷移的篩網(wǎng)。為了盡可能提高 DNA 分離的準(zhǔn)確性，需要選擇使用高質(zhì)量的瓊脂糖、大小合適的 DNA ladder 和高靈敏度的 DNA 染料。 Thermo Fisher Scientific 可提供多種經(jīng)優(yōu)化用于瓊脂糖凝膠電泳的試劑。

瓊脂糖凝膠用于 DNA 片段的分離和分析。制備凝膠時(shí)，需要瓊脂糖粉末和電泳緩沖液。賽默飛E-Gel 瓊脂糖預(yù)制膠是無需電泳緩沖液的瓊脂糖凝膠，在瓊脂糖基質(zhì)中嵌入了電極。每個(gè)瓊脂糖預(yù)制膠在包裝的透明塑料盒內(nèi)均包含離子發(fā)生系統(tǒng)、pH 平衡系統(tǒng)和 DNA 染料。還包括兩個(gè)與凝膠和電極接觸的離子交換矩陣（ion exchange matrice，以下簡稱 IEM）。IEM 在整個(gè)預(yù)制凝膠中提供持續(xù)的離子流，從而產(chǎn)生進(jìn)行電泳所需的持續(xù)電場。

E-Gel 預(yù)制凝膠電泳系統(tǒng)的三步法實(shí)驗(yàn)流程

E-Gel 預(yù)制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)包括電泳設(shè)備、用于圖像捕獲的相機(jī)、預(yù)制瓊脂糖凝膠、Ladder 和上樣緩沖液，共同作用以簡化核酸電泳實(shí)驗(yàn)流程。

三步法實(shí)驗(yàn)流程簡單又方便：

1. 上樣

2. 電泳

3. 分析

電泳過程無需緩沖液即可進(jìn)行，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少了繁瑣的操作。

E-Gel 瓊脂糖凝膠電泳和成像系統(tǒng)

與常規(guī)電泳方法相比，使用E-Gel 預(yù)制瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)更快的電泳設(shè)置、運(yùn)行和分析。

以下兩種E-Gel核酸電泳系統(tǒng)均具備：

l 直觀的用戶界面，配備預(yù)設(shè)的電泳程序

l 內(nèi)置透射儀，用于實(shí)時(shí)觀察電泳情況

l 高分辨率凝膠成像相機(jī)

l 圖像存儲(chǔ)和聯(lián)網(wǎng)能力

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)與技巧

I部分：向DNA樣本說再見——常見瓊脂糖凝膠電泳錯(cuò)誤

1. 使用水代替凝膠緩沖液或電泳緩沖液

瓊脂糖凝膠配制和電泳通常使用TAE或TBE緩沖液進(jìn)行。 如果您使用水進(jìn)行凝膠配制和跑電泳，您的凝膠將在電泳時(shí)很快融化。 TAE、TBE和水都是透明的溶液；因此，在配制時(shí)請(qǐng)檢查容器的標(biāo)簽。

2. 使用了錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖

DNA凝膠電泳所需的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖濃度為1.0%。濃度越高，小條帶的分辨率越高；反之，瓊脂糖濃度越低，大分子量條帶的分辨率和分離程度越高。 如果使用了錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖凝膠，就很難確定DNA條帶的可靠性。 當(dāng)使用低百分比濃度瓊脂糖凝膠時(shí)要小心；它們往往較軟，更容易破損。

3. 顛倒了電泳槽與電源連接線的方向

這是很容易犯的錯(cuò)誤，但是如果你不小心顛倒了電泳槽與電源連接線的方向，結(jié)果將會(huì)非常令人沮喪。 因?yàn)闃颖緯?huì)向相反方向移動(dòng)，而且由于上樣孔與凝膠的末端很近，您會(huì)丟失所有的樣本。 開始您的電泳后確保DNA樣本以正確的方向進(jìn)入凝膠；如果您看到您的條帶向錯(cuò)誤的方向移動(dòng)，請(qǐng)顛倒電源線的方向。

II部分： 瓊脂糖凝膠中實(shí)現(xiàn)更高分辨率的5種方法

1. 什么是適合于您的瓊脂糖凝膠電泳的正確緩沖液？

進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳所需的緩沖液類型，主要取決于DNA片段大小和電泳后的應(yīng)用。 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳最常見的兩種緩沖液是Tris-乙酸EDTA緩沖液（TAE）和Tris-硼酸EDTA緩沖液（TBE）。 因?yàn)閮煞N緩沖液的pH值都接近中性，所以緩沖液中的DNA都帶凈負(fù)電荷并向凝膠裝置正極(+)方向移動(dòng)。

對(duì)于小片段DNA (<1000 bp)，如果沒有計(jì)劃從凝膠中回收DNA，那么推薦使用1x TBE緩沖液。 TBE溶液具有高離子強(qiáng)度和緩沖能力。 TAE緩沖液，結(jié)合低電場強(qiáng)度（1–2 V/cm），分離大DNA（12–15 kb）。 TAE緩沖液與瓊脂糖相互作用，相比較TBE緩沖液中的瓊脂糖凝膠，會(huì)產(chǎn)生更低的電滲透，更大的表面孔經(jīng)，和更低的電場強(qiáng)度，可降低大DNA的smear現(xiàn)象。

2. 為了獲得分辨率您需要的DNA上樣量是多少？

DNA樣本量可以是各種各樣的，關(guān)鍵是您正在分離的DNA條帶的DNA含量。 最小可能被檢測(cè)的DNA的量依賴于所使用的染色方法（例如，使用SYBR Safe DNA凝膠染色可以檢測(cè)出 3 ng的DNA。 一個(gè)清晰且界限分明的條帶中DNA最大量為100 ng。

3. 凝膠配制如何影響條帶分辨率？

推薦的瓊脂糖凝膠厚度為3-4 mm；厚度超過5mm的凝膠會(huì)產(chǎn)生模糊的條帶和更高的染色背景。與此類似，覆蓋在電泳裝置中凝膠上的電泳緩沖液厚度為3-5mm。 緩沖液太多會(huì)降低DNA遷移率并造成條帶變形。

梳齒的厚度也很重要，它會(huì)顯著影響分辨率。 薄梳(1 mm)會(huì)給出界限清晰的條帶，而厚梳會(huì)產(chǎn)生厚條帶，導(dǎo)致分辨率降低。 梳齒應(yīng)充分清洗以去掉可能的殘留物，否則可能會(huì)在泳道內(nèi)產(chǎn)生波浪線。 此外，在去除梳齒前要先加入緩沖液，以減少瓊脂糖孔附近的撕裂。

4. 凝膠類型影響條帶分辨率嗎？

根據(jù)DNA的應(yīng)用和大小，瓊脂糖類型會(huì)影響DNA分辨率。 凝膠強(qiáng)度，凝膠融解溫度，和電滲透是選擇合適瓊脂糖時(shí)的重要因素。 Thermo Fisher提供一系列的瓊脂糖類型，專為特定片段大小和應(yīng)用的優(yōu)化結(jié)果而設(shè)計(jì)。

UltraPure™瓊脂糖是具有標(biāo)準(zhǔn)融解溫度的多用途瓊脂糖，專為常規(guī)分離分析而設(shè)計(jì)。 UltraPure™ 瓊脂糖可分離500 bp至23,000 bp范圍內(nèi)DNA和RNA。

UltraPure™瓊脂糖1000專為PCR片段和其它短DNA片段提供更高的分辨率的凝膠。 瓊脂糖1000更容易操作，因?yàn)樗哂懈鼜?qiáng)的凝膠結(jié)構(gòu)： 凝膠強(qiáng)度超過1,400 g/cm2。

作為低熔/凝固溫度的瓊脂糖，UltraPure™低熔點(diǎn)瓊脂糖被推薦用于快速DNA凝膠提取方案。 此瓊脂糖分離范圍為50 bp至1,000 bp。

5. 您如何選擇瓊脂糖凝膠電泳運(yùn)行環(huán)境？

推薦的凝膠電泳裝置內(nèi)的電壓是4–10 V/cm（正極和負(fù)極之間的距離，不是凝膠長度）。 如果電壓太低，遷移率會(huì)降低，而且條帶會(huì)因擴(kuò)散而變寬。 如果電壓太高，條帶分辨率會(huì)降低，這主要是由于凝膠過熱引起的。

#瓊脂糖凝膠電泳# #電泳# #瓊脂糖凝膠# #凝膠電泳# #電泳試劑# #DNA凝膠電泳#

賽默飛世爾科技（中國）有限公司