本文來源于微信公眾：生化尋蹤      作者：生化尋蹤

過去十幾年中，FDA批準的所有ADC都是由不同數量的藥物附著在單克隆抗體不同位置的ADC混合而成的。目前業界已經開發了一系列新的偶聯策略，旨在控制有效載荷的鏈接位置和數量，同時保持結構完整性和同質性。

    目前，偶聯技術可分為2類：①利用抗體序列中天然的具備反應活性的氨基酸殘基來介導的偶聯技術，包括抗體表面賴氨酸的側鏈氨基和鏈間二硫鍵還原后的巰基；②利用基因工程技術、化學修飾或酶修飾等在抗體特定位點引入可供反應的基團，再偶聯載荷毒素，實現特定位點偶聯，此類偶聯包括工程化半胱氨酸定點偶聯技術、非天然氨基酸定點偶聯技術、 酶介導的定點偶聯技術、糖鏈介導的定點偶聯技術等。

第一代抗體偶聯技術（隨機偶聯）

    傳統的 ADC 利用抗體賴氨酸的氨基或打開鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進行偶聯。一個抗體分子包含了 80 ~ 90 個賴氨酸，偶聯可能會發生在將近 40 個不同賴氨酸殘基上，打開鏈間二硫鍵會得到多個半胱氨酸殘基，同時破壞了抗體分子的完整性，因此傳統的 ADC 是高度異質混合物，其均一性差，穩定性低，影響藥效及治療窗。

第二代抗體偶聯技術

    通過引入生物正交分子到抗體中，然后利用引進的特殊位點進行定點偶聯，但是這些特殊位點的引進往往需要對抗體進行改造，這可能會改變抗體的部分性質，甚至會改變抗體的折疊或者穩定性。

1. 引入反應性半胱氨酸（THIOMAB技術）

Genentech最早利用了一種名為THIOMAB的定點偶聯技術，通過基因工程在抗體的特定點插入半胱氨酸殘基，在還原性條件下，引入的半胱氨酸及鏈間的二硫鍵被還原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫鍵，形成位點專一的抗體偶聯藥物。

    Thiomab 技術，工程化引入半胱氨酸，既不會干擾免疫球蛋白的折疊和組裝，也不會改變抗體抗原的結合模式，獲得的ADC藥物既保留了其體內抗腫瘤活性，還提高了耐受性、降低了系統毒性。該技術具有高均一性、較好的反應活性和穩定性等優點，缺點是需要基因修飾，通常DAR 2。 

    基于此，Seattle Genetics 和 Spirogen 開發了一種類似的技術，稱為 MAIA，通過在 mAb 關鍵區域的 239 位引入絲氨酸-半胱氨酸突變，用于其 PBD 二聚體的生物綴合。

2. 引入非天然氨基酸

    通過在抗體的原始序列中人工加入非天然氨基酸，使其在抗體表面呈現出可方便偶聯的特異性位點，從而獲得位點確定、DAR值均一的ADC。該偶聯技術du特之處在于可以隨意突變非天然氨基酸，并且得到任意DAR值的ADC，缺點是需要基因修飾、抗體表達量低、非天然氨基酸序列引起免疫原性和非天然氨基酸的疏水性引起聚集。

    引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸和疊氮賴氨酸。非天然氨基酸上帶有的酮基、疊氮基官能團可與藥物連接子發生化學反應，獲得 DAR 均一的 ADC。

3. 酶法偶聯

    抗體和小分子藥物可以利用酶法實現定點偶聯。酶法偶聯具備定點偶聯的優勢，但也存在引入額外序列而造成免疫原性的潛在弊端。因此，在產品開發過程中，需要對生成的 ADC 進行完善的免疫原性評估以確保其安全性。

第三代抗體偶聯技術

    第二代抗體偶聯技術雖然可以實現對抗體進行定點偶聯，但是需要對抗體進行特殊改造，這在一定程度上可能會給ADC藥物的開發帶來一些新的挑戰，因此有研究者開始考慮在不改變抗體完整的基礎上，對天然的抗體進行位點特異性偶聯。第三代偶聯技術主要是聚焦于選擇du特的氨基酸位點并利用du特的分子或者通過鄰近效應進行定點偶聯，其主要分為以下4種：1）鏈間二硫鍵改造；2）糖基修飾；3）化學選擇性的修飾；4）基于鄰近效應的修飾。

1. 二硫鍵重橋

二硫鍵重橋，又名 Disulfide re-bridging，是利用半胱氨酸選擇性交聯試劑（如TECP或DTT），將IgG1抗體中4個鏈間二硫鍵還原，隨后使用雙反應試劑在多肽鏈重新連接的同時，完成小分子有效載荷的安裝或抗體的進一步修飾。通過共價重新連接半胱氨酸殘基，既維持了二硫鍵的穩定作用，同時實現每個二硫鍵鏈接一個有效載荷的受控偶聯。

該偶聯方式具有高均一性、不影響抗體的空間結構、通用的氨基酸序列與糖基化修飾等優點，缺點是鏈內錯誤橋接，通常DAR 4。

     根據偶聯試劑的不同分類分為4類：單/雙砜類試劑； 3,4-二取代馬來酰亞胺；二溴噠嗪二酮和; 二乙烯基嘧啶。

2. 糖基偶聯

    IgG型抗體中存在兩個保守的糖基化位點N297，該位點位于CH2結構域，遠離抗體結合抗原的功能結構域，因此利用該位點進行偶聯不會對抗體的結合功能造成影響。

    ADC的糖基化偶聯技術不改變抗體的結構，無需進行抗體工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突變以便進行偶聯。目前可用Fc端糖基化偶聯技術有：糖基氧化的修飾、糖代謝工程、酶工程等。總的來說，利用該糖位點的偶聯，主要是通過在糖基上引入一個新的反應基團，然后再利用相關試劑進行定點偶聯。

2.1 基于糖基的氧化的修飾

    Fc端糖基的核心可以通過選擇性高碘酸鹽氧化修飾，然后與酰肼毒素小分子反應，形成具有完整免疫反應性的腙連接綴合物。這個技術早在gemtuzumab ozogamicin開發的時候就曾使用過，但抗體的敏感性導致了在氧化過程中抗體活性的損失，所以才采用的AcBut連接子的賴氨酸隨機偶聯技術。

2.2 代謝工程化修飾抗體寡糖

    通過代謝工程修飾抗體寡糖，在細胞培養基中摻入巖藻糖類似物6-硫代過乙酸鹽，以這種方式在糖基的核心處引入巰基，巰基可以作為使用馬來酰亞胺化學連接連接子-載荷的錨定點。

2.3  酶工程化修飾抗體寡糖

     利用糖基轉移酶，主要是通過在糖基上引入一個新的反應基團，然后再利用相關試劑進行定點偶聯。目前擁有酶工程糖基化偶聯技術的公司也有多家，包括Syniffix，康寧杰瑞和糖嶺生物等，但是具體使用的酶和linker接頭均有所不同。

    根據巖唐生物披露信息，其YTConju™技術平臺通過對抗體Fc區域保守的糖基化位點進行酶化學法改造，并利用高效的巖藻糖基轉移酶和改構后的巖藻糖衍生物實現了“一步法”偶聯。

    康寧杰瑞研發了具有自主知識產權，基于抗體CH2結構域糖鏈的定點偶聯技術，采用一酶兩步法，核心步驟為在β-1,4-半乳糖基轉移酶的催化作用下，UDP-GalNAz被轉移至抗體的末端已酰葡萄糖胺上，從而引入疊氮基團，進而為payload通過點擊化學的方法偶聯至抗體上。但對于抗體糖鏈末端的結構如何做到統一（抗體制備過程控制策略），是否需額外修飾，并無太多信息披露。

康寧杰瑞

    Synaffix公司創建的GlycoConnect™技術，包括用EndoS修剪Fc糖鏈，隨后轉移GalNAz或疊氮-半乳糖基團，以及最終點擊連接子-載荷。結合多種連接子-載荷選項，這項技術已被多家合作公司用來生成DAR 2的均質gsADC。

3.  化學選擇性修飾（略）

4.  鄰近誘導抗體偶聯技術

    探針和蛋白質的特定天然殘基（例如，賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸）之間進行選擇性反應的鄰近的偶聯方法正在成為一類重要的抗體偶聯方法。這些策略能夠制備位點特異性抗體偶聯物，而無需額外的抗體工程或額外修改。目前基于鄰近的偶聯的努力方向主要集中在新的鄰近誘導化學以及對抗體結構和功能的破壞較小的抗體結合劑上。

5. 其他偶聯技術

    賴氨酸與半胱氨酸作為廣泛使用的靶標，在化學反應方面具有顯著優勢。然而，異質性問題對其藥效性質產生了負面影響，進而影響毒性表現。基于內源性氨基酸的化學替代方法。其中，因酪氨酸、色氨酸、組氨酸的芳香族側鏈表現出du特的反應性和選擇性，多種基于芳香族側鏈改性的化學技術應運而生。

5.1  蛋氨酸（ReACT）

    蛋氨酸是一種主要負責保護人體免受氧化應激的氨基酸。因此，與其他氨基酸殘基相比，其功能化不太可能損害蛋白質的功能。另一個優勢是蛋氨酸的豐度較低(約1.8%)，這降低了特定標記的概率。但發現所得蛋氨酸偶聯物的穩定性一般，需要進一步優化才能成功應用于ADC 領域。

5.2   酪氨酸

    廣泛的雙正交標記策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚側鏈上的選擇性化學。酪氨酸出現在蛋白質序列的頻率中等 (自然豐度為3.3%)，從而為其du特的苯酚側鏈的位點選擇性標記提供了機會。盡管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白質表面，但它也可以參與氫鍵，并且由于其氧化還原潛力，可以形成酪氨酸自由基，使電子轉移。因此，酪氨酸殘基經歷了高度多樣化的生物修飾，如硝化、氧化、交聯、AMP化、鹵化或糖基化。