一、背景

放線共生放線桿菌PCR試劑盒是一種用于檢測放線共生放線桿菌的分子生物學試劑。該試劑盒通常包含用于擴增特定DNA片段的引物、DNA聚合酶以及其他的必需試劑，能夠在PCR儀中運行，對特定的DNA序列進行快速、靈敏的檢測。

二、放線共生放線桿菌PCR試劑盒實驗操作

1、放線共生放線桿菌PCR試劑盒模板制備（樣本制備區）

建議使用配套水生動物病害基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見產品說明書。

2、添加模板（模板添加區，放置于冰盒中進行）

請于-20℃條件下保存，有效期12個月

取出所需測試數的已含有反應液A-TSV-I的PCR管，將試劑解凍，離心30秒，在管蓋上標記管名（陰性對照管NG、樣品XX、陽性對照管PG）。打開管蓋向各管管底分別加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，蓋上陰性對照管管蓋，其他各管分別沿管壁加入2μL模板，順序為待測樣品模板、PG-TSV-I，依次蓋好各管管蓋，離心30秒，立即進行擴增反應。

3、放線共生放線桿菌PCR試劑盒擴增反應（擴增及產物分析區）

①恒溫儀器63℃條件下反應60 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設置實驗名稱及反應時間，將步驟2中離心后的PCR反應管放入恒溫熒光分子檢測儀，點擊開始檢測。

②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃15 s，63℃45 s作為一個循環，于63℃45 s處收集熒光信號，60個循環。

其他儀器請參照儀器說明書進行設置。

4、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。

5、數據處理

如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

三、應用

放線共生放線桿菌PCR試劑盒可以用于牙周病原菌在牙周病人齦下菌斑中的分布研究：

牙周病原菌在牙周病人銀下菌斑中的分布研究目的應用聚合酶鏈式反應分別檢測牙周病人釀下菌斑中的10種牙周病原菌，觀察其分布特點，并初步分析不同的細菌組合與牙周病的關系。

材料與方法：使用放線共生放線桿菌PCR試劑盒將聚合酶鏈式反應擴增出牙釀葉琳菌部分165 rRNA基因片段的實驗方法推廣致更多的牙周病病原菌。根據各自特異區的165 rRNA基因(165 rDNA)序列，分別合成10種牙周病病原菌:牙跟葉琳菌(Pg)，福塞類桿菌(Bf)，中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)，變黑普里沃菌(Pn)，直型彎曲桿菌(Cr)，溶蝕艾肯菌(Ec)，放線共生放線桿菌(Aa)，黃褐二氧化碳噬纖維菌(C。)，生痰二氧化碳噬纖維菌(CS)的特異引物，然后隨機選擇62位患者，其中牙周健康者16例，慢性邊緣性牙跟炎患者17例，慢性牙周炎患者29例，每例選兩個位點，分別取兩份跟下菌斑標本，共124份樣本。

同時記錄各病例的一般情況：年齡，性別，吸煙情況和各項臨床指標:探查袋深，探診出血情況等，牙周炎患者同時記錄附著水平。提取菌斑中的DNA，分別用10對特異引物，TaqDNA聚合酶等以及放線共生放線桿菌PCR試劑盒在適宜的條件和溫度下進行聚合酶鏈式反應，反應產物在加入0.sug/m1澳化已錠(EB)的1.50rk瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下進行觀察，采用DLZ000 DNA marker記錄電泳DNA片段大小，檢測是否出現與特異引物相對應的特異擴增帶，以鑒定細菌種類。用統計軟件分析細菌與病例一般情況與各項臨床指標的關系。

結果：10種牙軍醫進修學院碩士學位論文周病病原菌在各組中都有檢出，其中跟炎組牙跟葉琳菌(Pg)，中間型普里沃菌(pi)和齒垢密螺旋體(Td)的檢出率高于健康組;牙周病組牙齲葉琳菌(Pg)，福塞類桿菌(Bf)，中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)，變黑普里沃菌(Pn)和黃褐二氧化碳噬纖維菌(Co)的檢出率高于健康組;牙周病組的中間型普里沃菌(Pi)，齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)高于齲炎組。

隨年齡增大，齒垢密螺旋體(Td)的檢出率增加;女性齲下菌斑中的牙跟葉琳菌(Pg)檢出率多于男性;不吸煙者患者中檢出較多的牙齲葉琳菌(Pg)。中間型普里沃菌(Pi)、齒垢密螺旋體(Td)和變黑普里沃菌(Pn)與牙周病關系更為密切。

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