枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種土壤來(lái)源的低G+C、內(nèi)生孢子革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，也是一種重要的原核表達(dá)宿主，具有很高的應(yīng)用價(jià)值，其培養(yǎng)簡(jiǎn)單快速，具有較強(qiáng)的分泌蛋白質(zhì)的能力、非致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，是目前生產(chǎn)各種工業(yè)用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表達(dá)宿主，是微生物研究領(lǐng)域中的一種重要模式菌株。目前，已經(jīng)有很多外源基因在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中成功復(fù)制、表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)將會(huì)帶來(lái)更高效、更經(jīng)濟(jì)、更安全的應(yīng)用價(jià)值。

一、枯草芽孢表達(dá)系統(tǒng)介紹

1、枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵優(yōu)缺點(diǎn)

相較于傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，枯草芽孢桿菌的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯，它作為基因工程菌的出發(fā)菌具有巨大潛力和優(yōu)勢(shì)：

（1）非致病性。枯草芽孢桿菌在自然界中廣泛存在于動(dòng)物腸道當(dāng)中，被認(rèn)為是腸道益生菌，有一定制備發(fā)酵食物的歷史，不產(chǎn)制熱致敏蛋白質(zhì)和各種毒素，安全程度可以達(dá)到食品級(jí)。

（2）枯草芽孢桿菌細(xì)胞具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)胞外分泌能力，大約有300多種蛋白質(zhì)可以被直接分泌至胞外，相比較工業(yè)上常用的宿主菌大腸桿菌而言，簡(jiǎn)化甚至可以去除部分目的蛋白的純化步驟。

（3）枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不容易形成包涵體。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，如果待表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的編碼序列含有大量連續(xù)的稀有密碼子，那么表達(dá)水平通常偏低，甚至翻譯提前終止；包涵體導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可溶，這使得難以分離和純化目的蛋白質(zhì)，但是枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)不存在以上問(wèn)題，在這些方面表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

（4）枯草芽孢桿菌是好氧嗜溫菌，不需要制造無(wú)氧環(huán)境，也不需要特殊的培養(yǎng)基，培養(yǎng)周期短，生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵所需的培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，發(fā)酵技術(shù)成熟，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

然而，對(duì)于枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究起步較晚，仍有很多需要人們繼續(xù)探索的方面：

（1）盡管模式菌株的全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，但仍有近50％基因的功能尚不明確；

（2）自然界中能自發(fā)形成感受態(tài)細(xì)胞狀態(tài)的菌株較少，感受態(tài)持續(xù)時(shí)間短，轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化方法針對(duì)性較強(qiáng)；

（3）枯草芽孢桿菌內(nèi)部存在限制性修復(fù)系統(tǒng)，重組質(zhì)粒易不穩(wěn)定，造成質(zhì)粒丟失；

（4）自身胞外蛋白酶表達(dá)能力強(qiáng)，可能引起目的蛋白降解；

（5）拷貝數(shù)通常較低，蛋白表達(dá)量不高；

（6）芽孢桿菌菌株多樣性高，其啟動(dòng)子復(fù)雜性高，目前己知的σ因子有14種之多，兼容性不強(qiáng)。

2、枯草芽孢桿菌表達(dá)載體

常用的枯草芽孢桿菌表達(dá)載體分為三類(lèi)：噬菌體載體、整合型質(zhì)粒載體和自主復(fù)制型質(zhì)粒載體，其中自主復(fù)制的質(zhì)粒應(yīng)用最多，整合型質(zhì)粒能夠有效解決重組質(zhì)粒在宿主內(nèi)不穩(wěn)定、易丟失這一問(wèn)題。

目前常用的質(zhì)粒載體有：穿梭質(zhì)粒載體pEB60，pUB18，pEB10和pWB980，整合型載體pMutin-GFP+，pSG115，pMutin4，pSG1156，詳情見(jiàn)下表。

3、枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子基本結(jié)構(gòu)

（1）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

啟動(dòng)子是調(diào)控外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵元件，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游，可以供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合，使酶與啟動(dòng)子形成二元復(fù)合物，從而與模板DNA準(zhǔn)確結(jié)合并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。原核啟動(dòng)子的核心區(qū)域?yàn)門(mén)SS上游200bp至下游100bp，該區(qū)域存在小段保守序列，如枯草芽孢桿菌sextama-35區(qū)（TTGACA）、Pri-bmow-10區(qū)（TATAAT），根據(jù)這些保守序列可以對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)測(cè)和分析。

（2）枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子的σ因子

原核基因的RNA聚合酶由5個(gè)亞基組成，分別為α亞基、β亞基、β'亞基、ω因子和σ因子。σ因子能夠協(xié)助核心酶識(shí)別特定啟動(dòng)子序列，以便結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始部位，σ因子與核心酶瞬時(shí)結(jié)合，二者的結(jié)合與分離為RNA聚合酶的重組提供機(jī)會(huì)，轉(zhuǎn)錄開(kāi)始后σ因子就不再有作用。目前，已知的枯草芽孢桿菌σ因子有14種，每一種σ因子的功能和數(shù)量并不相同，其中含量最多的是σA因子，它是轉(zhuǎn)錄必須基因，是營(yíng)養(yǎng)期最重要的σ因子，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄管家基因，相關(guān)基因數(shù)約358個(gè)，占σ因子總量的90%~95%，相當(dāng)于大腸桿菌中的σ70。

4、啟動(dòng)子的分類(lèi)

對(duì)于重組蛋白的生產(chǎn)，啟動(dòng)子強(qiáng)弱直接決定了該蛋白的表達(dá)水平。根據(jù)不同啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平能力的不同，可以將其分為強(qiáng)啟動(dòng)子和弱啟動(dòng)子；根據(jù)啟動(dòng)子誘導(dǎo)機(jī)制的不同，又可以分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、時(shí)期特異性啟動(dòng)子和自誘導(dǎo)啟動(dòng)子。本文主要介紹的是枯草芽孢桿菌的組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

（1）組成型啟動(dòng)子

組成型啟動(dòng)子又稱非特異性啟動(dòng)子，是指不需要添加任何誘導(dǎo)物就可以持續(xù)表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，它的啟動(dòng)能力強(qiáng)，成本低，常被用于構(gòu)建載體時(shí)的表達(dá)元件。常見(jiàn)的枯草芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子有P43啟動(dòng)子和噬菌體啟動(dòng)子，其中P43被普遍應(yīng)用于各種研究，是胞苷脫氨酶基因(cdd)的啟動(dòng)子，它是有σA和σB兩個(gè)因子負(fù)責(zé)識(shí)別的重疊啟動(dòng)子。研究表明，組成型啟動(dòng)子P43的啟動(dòng)強(qiáng)度強(qiáng)于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PamyE和PsacB。

（2）誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指受環(huán)境變化或化學(xué)誘導(dǎo)來(lái)調(diào)控基因表達(dá)的啟動(dòng)子，在代謝工程中，可以針對(duì)不同誘導(dǎo)型啟動(dòng)子改變誘導(dǎo)劑的種類(lèi)及濃度，實(shí)現(xiàn)目的基因不同強(qiáng)度的表達(dá)。誘導(dǎo)劑可以與阻遏蛋白Lac I結(jié)合，使之與操縱位點(diǎn)分離，致下游基因得到表達(dá)。

在枯草芽孢桿菌中見(jiàn)的誘導(dǎo)劑是IPTG、木糖和蔗糖。除此之外，Yang等構(gòu)建的以誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pglv(Pglv-M1)為表達(dá)元件的表達(dá)系統(tǒng)也在枯草芽孢桿菌中得到廣泛應(yīng)用，該啟動(dòng)子以麥芽糖作為誘導(dǎo)物，價(jià)格低廉，安全無(wú)毒，且對(duì)代謝反應(yīng)元件cre進(jìn)行突變改造后獲得的新啟動(dòng)子Pglv-M1受到葡萄糖的抑制作用大大降低，工業(yè)應(yīng)用價(jià)值較大。

5、通過(guò)啟動(dòng)子改造實(shí)現(xiàn)基因高效表達(dá)

a.啟動(dòng)子的克隆

目前，針對(duì)啟動(dòng)子的克隆方法主要有三種，一是啟動(dòng)子探針載體篩選法，二是PCR技術(shù)克隆法，三是軟件分析法。

利用探針型載體篩選、克隆啟動(dòng)子是指通過(guò)限制性內(nèi)切酶隨機(jī)切割外源ＤＮＡ得到不同大小的核苷酸片段（擬啟動(dòng)子片段），將這些片段連接到含有互補(bǔ)粘性末端的載體上，檢測(cè)下游報(bào)告基因的表達(dá)活性，以判斷擬啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性。

構(gòu)建啟動(dòng)子探針型質(zhì)粒載體常見(jiàn)的報(bào)告基因有綠色熒光蛋白報(bào)告基因、熒光素酶基因、四環(huán)素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因等。

軟件分析法是通過(guò)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和大數(shù)據(jù)分析，常見(jiàn)的分析平臺(tái)有Sofiberry等,可以對(duì)一段序列進(jìn)行是否存在啟動(dòng)子的判斷及位置分析，同時(shí)還可以模擬啟動(dòng)子能力強(qiáng)弱,方便快捷，但是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的分析可能存在一定誤差，還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

b.改造啟動(dòng)子以實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)

目前大多用于外源表達(dá)的啟動(dòng)子為天然啟動(dòng)子，啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄能力的強(qiáng)弱與其自身結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。常見(jiàn)的啟動(dòng)子改造辦法有以下幾種：構(gòu)建復(fù)合啟動(dòng)子；啟動(dòng)子核心保守區(qū)域替換雜交；啟動(dòng)了保守序列突變等。

（1）構(gòu)建復(fù)合啟動(dòng)子

自然界中，除了單個(gè)啟動(dòng)子作用于一個(gè)基因的情況，還存在復(fù)合啟動(dòng)子作用于一個(gè)基因的情況，如雙啟動(dòng)子或者重疊啟動(dòng)子等。復(fù)合啟動(dòng)子可以提供更多的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，使外源基因的轉(zhuǎn)錄水平高于單啟動(dòng)子。用于表達(dá)B-環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的復(fù)合啟動(dòng)子Hpa-Panye-表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量是單啟動(dòng)子Pay，表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量的1.3倍。

（2）啟動(dòng)子核心保守區(qū)域替換雜交

枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子的核心保守區(qū)域有sextama-35區(qū)和Pri-bmow-10區(qū)，它們的典型序列是TTGACA和TATAAT。-35區(qū)和-10區(qū)分別是識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶的區(qū)域，不同啟動(dòng)子這兩個(gè)區(qū)域?qū)NA聚合酶的識(shí)別、結(jié)合能力可能略有不同，若將不同啟動(dòng)子的強(qiáng)識(shí)別或強(qiáng)結(jié)合的優(yōu)勢(shì)區(qū)域組合替換雜交，使其進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)形成優(yōu)勢(shì)的核心區(qū)域，則會(huì)更好的開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。

二、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用進(jìn)展

枯草芽孢桿菌的研究無(wú)論在理論還是產(chǎn)品應(yīng)用開(kāi)發(fā)等方面均已取得巨大成功，如工業(yè)發(fā)酵、傳統(tǒng)發(fā)酵食品制備和植物病害生物防治等。

1、枯草芽孢桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)成本低、耗費(fèi)時(shí)間少且有利于環(huán)境，是一種重要的表達(dá)宿主，既是有益菌，又是表達(dá)外源蛋白的工具，已廣泛用于合成生物學(xué)、代謝工程和工業(yè)酶的生產(chǎn)。重組枯草芽孢桿菌的發(fā)酵能力強(qiáng)，在大規(guī)模發(fā)酵中表現(xiàn)出的潛力，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，已證明枯草芽孢桿菌 WB600 可以作為生產(chǎn) BglTO 的合適宿主，其產(chǎn)物活性與已有商業(yè)酶相比更高效，有望在釀造工業(yè)中應(yīng)用。此外，β-甘露聚糖酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)、有機(jī)溶劑耐受蛋白酶(OSP)、杜納糖等多種工業(yè)產(chǎn)品均已成功在枯草芽孢桿菌中表達(dá)。

2、枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌對(duì)人類(lèi)是安全的，被界定為“GRAS”(Generally Ｒecognized as Safe)，其在工業(yè)生產(chǎn)、疫苗開(kāi)發(fā)、環(huán)境保護(hù)和肽庫(kù)構(gòu)建中都起到重要作用。將枯草芽孢桿菌 MF497446 施用到受鎘(Cd)污染的土壤中，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)并消除(或至少減少)農(nóng)作物中 Cd 的積累，確保食品安全，降低人類(lèi)健康風(fēng)險(xiǎn)。作為安全宿主，在枯草芽孢桿菌168中通過(guò)表達(dá)GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)可以提高茶氨酸的產(chǎn)量。

3、枯草芽孢桿菌在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)具有藥理活性的重組蛋白方面具有多種優(yōu)勢(shì)，如質(zhì)量和效率、安全性和分泌能力等，因此優(yōu)于大腸桿菌。枯草芽孢桿菌是一種具有益生菌特性的內(nèi)生孢子和生物膜形成細(xì)菌，其芽孢具有的物理、化學(xué)以及生化特性，是口服疫苗遞送的強(qiáng)大平臺(tái)。通過(guò)構(gòu)建一系列重組枯草芽孢桿菌菌株，測(cè)試了口服芽孢后狗的免疫應(yīng)答能力，并據(jù)此建立了枯草芽孢桿菌用作腸道疫苗制劑的主要步驟。研究也已證明枯草芽孢桿菌芽孢的口服遞送可抵抗草魚(yú)呼腸孤病毒感染。

三、總結(jié)

枯草芽孢桿菌是科學(xué)研究中的重要模式菌種，是一種具有研發(fā)潛力的微生物，其安全系數(shù)高、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、高效且應(yīng)用廣泛，現(xiàn)已逐漸發(fā)展成生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著基礎(chǔ)研究和應(yīng)用技術(shù)更深入的研究和推進(jìn)，未來(lái)枯草芽孢桿菌將成為一個(gè)超級(jí)分泌細(xì)胞工廠。

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