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實驗室植物組織培養外植體消毒步驟和注意事項有哪些?

來源:北京百歐博偉生物技術有限公司   2025年06月25日 16:28  

百歐博偉生物:植物組織培養中外植體的消毒是一個關鍵步驟,直接影響培養的成功率。以下是詳細的消毒步驟和注意事項:

 

一、外植體預處理

 

1、清洗:用自來水沖洗外植體,去除表面泥土和雜質。對多毛或蠟質層較厚的組織,可加入少量洗潔精浸泡10-15分鐘,增強消毒劑滲透。

 

2、切割:將外植體切成適宜大小(如葉片切成0.5-1 cm2),增加消毒劑接觸面積。操作需在無菌環境下進行,工具需滅菌。

 

二、常用消毒劑及步驟

 

1、70%乙醇:浸泡30秒至1分鐘,快速滅殺表面微生物。適用于大多數外植體,但對幼嫩組織需縮短時間。

 

2、次氯酸鈉(NaClO):濃度5-10%(商用漂白液稀釋),浸泡10-20分鐘。分解后釋放氯氣殺菌,需無菌水沖洗3-5次。適用于莖段、種子等較硬組織。

 

3、雙氧水(H?O?):3-10%濃度浸泡5-15分鐘,分解為水和氧氣,無殘留。適用于種子或內部有空隙的組織。

 

4、其他消毒劑:HgCl?,0.1%濃度)因毒性強已少用,必要時需嚴格處理廢液。

 

三、特殊處理

 

1、內生菌問題:若外植體內部帶菌,可在培養基中添加抗生素(如頭孢霉素50-100 mg/L),但需測試對植物生長的影響。

 

2、復雜外植體:如塊莖或果實,可結合酒精擦拭表面后二次消毒。

 

四、無菌操作要點

 

1、超凈工作臺:全程在無菌環境下操作,使用前紫外線滅菌30分鐘。

 

2、工具滅菌:鑷子、解剖刀等需高溫高壓滅菌或火焰灼燒冷卻后使用。

 

3、無菌水沖洗:每次消毒后至少沖洗3次,去除殘留消毒劑。

 

五、污染控制與優化

 

1、污染觀察:接種后2-7天密切觀察,若污染率高需調整消毒時間或濃度。

 

2、存活率平衡:幼嫩組織(如葉片)可縮短次氯酸鈉處理至5-10分鐘;堅硬組織(如種子)可延長至20分鐘。

 

3、預處理優化:對帶絨毛外植體,乙醇預處理時間延長至1-2分鐘,增強次氯酸鈉滲透。

 

六、注意事項

 

1、個體差異:不同植物種類、位對消毒耐受性不同,需預實驗確定條件。

 

2、環境因素:野外采集樣本需更嚴格消毒(如兩次次氯酸鈉處理),溫室材料可適當減少步驟。

 

3、安全防護:操作有毒消毒劑時穿戴手套、護目鏡,避免直接接觸。

 

示例流程(以葉片為例)

 

自來水沖洗葉片30分鐘,軟毛刷輕刷表面。

 

70%乙醇浸泡40秒,無菌水沖洗1次。

 

5%次氯酸鈉溶液浸泡12分鐘,期間輕輕搖動。

 

無菌水沖洗5次,置于滅菌濾紙上吸干水分。

 

接種至培養基,25℃暗培養3天后觀察污染情況。

 

通過系統優化消毒方案,可顯著提高外植體存活率并降低污染風險,為后續愈傷組織誘導或再生培養奠定基礎。

 

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