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聚合酶鏈式反應(PCR)關鍵要素詳解

來源:上海邦景實業有限公司   2025年06月25日 13:32  

 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應是一個強大的分子生物學技術,用于擴增特定的DNA片段。PCR反應指在DNA聚合酶催化下,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,體系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、擴增增強因子,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程,能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。PCR反應將微量目的DNA片段擴增一百萬以上,它以敏感度高,特異強,產率高,重復好,以快速簡便優點迅速成分子生物學研究中最為廣泛的方法。

PCR反應的成功依賴于五個關鍵要素:

1. 引物:

1) 引物是一段短的DNA序列,用于與目標DNA模板的特定區域配對。

2) 設計原則包括長度(1530 bp)、G+C含量(40%60%)、避免二級結構和引物間互補等。

3) 通常每條引物的濃度為0.10.5 μmol/L,過高可能導致非特異性擴增。

2. 模板DNA:

    是待擴增的DNA序列,可以是基因組DNA、cDNA或質粒DNA。

    數量和純度對結果至關重要,通常使用102105拷貝,但過量可能增加非特異性產物。

    單鏈和雙鏈DNA均可作為模板,但線性DNA比環狀DNA擴增效果更好。

3. DNA聚合酶:

1) 負責催化DNA合成,常用的是Taq DNA聚合酶,因其耐高溫特性。

2) 其他如Pfu、Phusion等酶具有更高保真度,適用于特定應用。

3) 酶的濃度通常為1.02.5 U/100 μL反應液,過高或過低均影響擴增效率。

4. dNTPs(脫氧核苷三磷酸):

1) 作為DNA合成的原料,通常等量加入反應體系,終濃度為20200 μmol/L。

2) 濃度過高可能抑制Taq酶活性,影響產物特異性。

5. Mg2+:

1) 作為DNA聚合酶的輔助因子,影響酶活性和產物特異性。

2) 終濃度通常為0.52.5 mmol/L,需要根據引物Tm值和dNTP濃度調整。

此外,PCR反應還需要緩沖液提供適宜的pH和離子環境,以及適當的溫度控制(變性、退火、延伸三個階段)來完成循環擴增。
 


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