一、細胞簡介

平臺編號：Bio-73445

規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶

細胞信息：C6/36

細胞名稱：C6/36（蚊子細胞）

種屬：蚊子

年齡（性別）：幼蟲

生長特性：貼壁

生長培養(yǎng)基：MEM＋10% FBS＋1% P/S

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5% 溫度：28℃

用途：研究

注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準）

二、產(chǎn)品特點

特點：細胞代數(shù)為4-5代左右

包裝：內(nèi)層無菌自封袋；專用防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋；說明書

細胞來源：ATCC、sciencell、ICLC

貨期：1-2周

運輸方式：快遞運輸

形態(tài)：上皮細胞樣

三、細胞的凍存和復蘇

實驗方法原理

細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損傷。

四、操作流程

（一）材料準備

1、儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3、塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5、試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。

（二）蚊子細胞C6/36系細胞凍存

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

2、取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。

3、離心1 000 rpm，5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml。

5、將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

6、在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

7、凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（三）細胞復蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2、從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3、離心， 1 000 rpm，5 min。

4、棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

五、適用范圍

1、從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但為對數(shù)生長期細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。

2、將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護工作，以免凍傷。

3、凍存和復蘇用新配制的培養(yǎng)液。

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