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從“細菌工廠”到“酶促智造”：doggybone DNA如何改寫質粒生產規則？
胞與基因治療領域近年來取得顯著進展，其中AAV載體采用三質粒共轉染技術，CAR-T治療基于慢病毒四質粒瞬轉體系，二者已成為當前主流技術路徑。行業快速發展導致GMP級質粒DNA需求驟增，然而傳統大腸桿菌發酵工藝存在的污染風險和穩定性缺陷，嚴重限制了高質量質粒的規模化生產。
英國Touchlight公司開發的doggybone DNA（dbDNA）技術突破傳統局限，利用phi29 DNA polymerase結合TelN Protelomerase的體外酶法合成體系，完quan 規避細菌培養環節，從源頭消除發酵工藝風險。該技術不僅能簡化生產流程，更能快速制備符合GMP標準的DNA產物，為DNA/mRNA疫苗模板制備及病毒載體生產提供了創新解決方案。
DNA酶法合成工藝流程
圖1. DNA酶法合成流程圖[1]
整個dbDNA的生產流程簡潔而高效，主要分為以下四步：
模板變性
環狀質粒DNA模板通過變性處理，將其轉化為兩個單鏈環狀DNA。
滾環擴增
利用Phi29 DNA聚合酶以單鏈環狀DNA為模板，進行滾環擴增，生成具有端粒酶識別序列間隔的長線性雙鏈多聯體DNA。
切割及共價閉合
TelN端粒酶識別多聯體DNA上的端粒酶識別序列（telRL）發揮切割和連接活性，生成線性、末端共價連接DNA單體。
去除細菌骨架DNA
限制性內切酶或核酸外切酶降解末端具有開放結構的細菌骨架DNA得到僅含有目標基因表達元件的DNA。
為推動DNA酶法合成技術的發展，翌圣生物可提供DNA酶法合成的核心酶原料：phi29 DNA polymerase（14404ES）及TelN Protelomerase（14540ES）等，助力DNA酶法合成技術研發生產。
phi29 DNA polymerase（14404ES）
phi29 DNA polymerase具有的鏈置換和持續合成能力，可合成長達70 kb的DNA片段。此外，其3’→5’核酸外切酶校讀活性較強，其保真度高于目前絕大多數DNA聚合酶，確保了DNA合成的高保真性。這些顯著的優勢使得phi29 DNA聚合酶在多種DNA擴增技術中得到了廣泛應用，如多重置換擴增（MDA）和滾環擴增（RCA）等。
圖2. RCA原理圖[2]
A: 以單引物擴增產生長鏈DNA；B: 以隨機引物擴增產生長鏈串聯DNA
高靈敏度：可對pg級別的DNA模板進行有效擴增
圖3. 翌圣及進口品牌phi29 DNA聚合酶不同DNA模板投入量擴增結果。C1:無模板對照，C2：無酶對照。結果顯示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）靈敏度及擴增產量優于進口品牌
高擴增產量：100ng模板投入，產量可達2 μg/μL，有利于模板DNA等規模化放大
圖4. 翌圣phi29 DNA聚合酶擴增產量。模板：293細胞gDNA，投入100ng；反應時間：16h。結果顯示翌圣phi29 DNA聚合酶（Cat#14404ES）在100ng模板投入量下，擴增產量可達到2 μg/μL
翌圣TelN Protelomerase (14540ES)
TelN Protelomerase具有切割-連接活性，可用于合成線性閉合mini DNA載體，其在識別位點TelRL（56bp）切割雙鏈DNA，并在酶切位點處留下共價封閉的發夾結構，有效地將環狀DNA轉化為有發夾末端的線性DNA。在實際應用中會將質粒上的目的片段和骨架序列通過TelRL位點進行間隔。
作用機制：
1）切割：TelN識別特定的DNA序列（telRL位點），并在該位點精確切割雙鏈DNA。
2）連接：切割后，TelN將DNA末端共價連接，形成穩定的線性閉合結構。
圖5. TelN端粒酶切割位點
切割-連接性能優異，與進口品牌相當
以含有TelN端粒酶識別位點的超螺旋質粒為模板，梯度加入（0.078-5 U）翌圣及進口品牌A*的TelN端粒酶將0.5 μg超螺旋質粒轉換成封閉線性雙鏈DNA，凝膠電泳檢測轉換效率，結果顯示翌圣TelN端粒酶的切割-連接活性與進口品牌A*相當。
圖6. TelN端粒酶切割活性檢測 M：Marker，C：超螺旋質粒對照
雙鏈DNA末端閉合完整性>90%
以含有TelN端粒酶識別位點的超螺旋質粒為模板，加入翌圣及進口品牌A*的TelN端粒酶，將0.5 μg超螺旋質粒轉換為封閉線性雙鏈DNA，再加入T5核酸外切酶通過條帶降解程度來檢測其末端完整性，結果顯示翌圣的TleN端粒酶生成的雙鏈DNA末端閉合完整性>90%，與進口品牌A*相當。
圖7. TelN端粒酶末端閉合完整性檢測
C1：含TelN識別位點質粒，不加TelN端粒酶與T5核酸外切酶；
C2：含TelN識別位點質粒，加TelN端粒酶，不加T5核酸外切酶；
A*：含TelN識別位點質粒，加A*的TelN端粒酶，加T5核酸外切酶；
Yeasen：含TelN識別位點質粒，加Yeasen的TelN端粒酶，加T5核酸外切酶
DNA酶法合成相關產品
產品定位 | 產品名稱 | 產品貨號 |
端粒酶* | TelN Protelomerase (5 U/μL) | 14540ES |
phi29 DNA 聚合酶* | phi29 DNA Polymerase (10 U/μL) | 14404ES |
核酸外切酶 | Exonuclease III | 14525ES |
T5 Exonuclease (10 U/µL) | 14538ES | |
限制性內切酶 | BspQI GMP-grade (10 U/μL) | 10664ES |
Bsa I GMP-grade (20 U/μL) | 10661ES | |
…… | …… |
*在某些應用場景下，使用此酶會有zhuan li限制。
參考文獻
[1] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.
[2] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomere and telomerase biology. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Linear closed mini DNA generated by the prokaryotic cleaving-joining enzyme TelN is functional in mammalian cells. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[4] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu S, Xie XS. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology and Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015;16:79-102.
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