熒光定量PCR（qPCR）是一種廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測和基因分型的技術。羅氏LightCycler® 480是一款常用的熒光定量PCR儀，具有高靈敏度和穩定性。以下為詳細操作步驟，供參考使用。

一、實驗前準備

1. 儀器檢查

• 確認LightCycler® 480主機、電腦及軟件處于正常工作狀態。

• 檢查加熱蓋是否清潔，避免污染或殘留物影響實驗結果。

• 確保電源連接穩定，避免實驗過程中斷電。

2. 耗材與試劑準備

• DNA模板或cDNA

• 引物和探針（如TaqMan探針或SYBR Green染料）

• 聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

• dNTPs

• 緩沖液

• 使用兼容的PCR反應板或毛細管（如96孔板或384孔板）。

• 準備熒光定量PCR試劑，包括：

• 若使用探針法，需確認探針與儀器檢測通道匹配（如FAM、HEX等）。

3. 環境準備

• 實驗區域需清潔，避免氣溶膠污染。

• 建議在超凈臺或通風櫥中配制反應體系，減少外源DNA污染風險。

二、反應體系配制

1. 計算反應體積

• 根據樣本數量和實驗設計，計算所需試劑總量（通常單反應體積為10-20 μL）。

• 預留額外10%體積以補償移液誤差。

2. 配制主混合液（Master Mix）

• 將除模板外的所有試劑（緩沖液、dNTPs、引物、探針、聚合酶等）混合，渦旋振蕩后短暫離心。

• 分裝至PCR板或毛細管中，避免產生氣泡。

3. 加入模板

• 在單獨區域加入DNA或cDNA模板，避免交叉污染。

• 每孔模板體積需保持一致（如2-5 μL）。

• 設置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照。

4. 密封反應板

• 使用光學密封膜覆蓋反應板，確保密封性。

• 若使用毛細管，需檢查是否閉合。

三、程序設置與運行

1. 啟動軟件

• 打開LightCycler® 480軟件，選擇“New Experiment”創建新實驗。

• 設置實驗名稱、保存路徑及用戶信息。

2. 編輯程序

• 95℃ 10秒 → 65℃ 60秒 → 95℃連續升溫（0.1℃/秒）并采集熒光。

• 變性：95℃ 10-30秒

• 退火：50-60℃ 10-30秒（根據引物Tm值調整）

• 延伸：72℃ 10-30秒（視產物長度而定）

• 預變性階段：95℃維持3-10分鐘，激活聚合酶。

• 擴增循環（通常35-45個循環）：

• 熒光采集：在退火或延伸階段采集信號（根據染料類型選擇單色或多色檢測）。

• 熔解曲線分析（僅SYBR Green法）：

3. 板布局設置

• 在軟件中定義樣本位置，標注對照孔和待測樣本孔。

• 選擇熒光通道（如FAM對應通道1，HEX對應通道2）。

4. 運行程序

• 將反應板放入儀器，確認放置平穩。

• 點擊“Start”開始運行，實時監測擴增曲線。

四、數據分析

1. 基線調整

• 軟件自動或手動設置基線范圍（通常為前3-15個循環）。

• 確保擴增曲線在閾值線（Threshold）附近呈現清晰的指數增長。

2. 閾值設定

• 手動調整閾值線至指數增長期上方，軟件自動計算Ct值（循環閾值）。

3. 結果解讀

• 定量分析：通過標準曲線計算模板濃度（絕對定量）或比較ΔΔCt值（相對定量）。

• 熔解曲線：SYBR Green法需檢查單峰（特異性擴增）或多峰（引物二聚體或污染）。

• 排除異常值（如NTC出現擴增提示污染）。

4. 導出數據

• 保存實驗文件，導出Ct值、熔解曲線等數據。

• 生成報告（PDF或Excel格式）。

五、實驗后處理

1. 儀器維護

• 關閉軟件和主機電源，清潔反應槽及加熱蓋。

• 定期進行校準（如光學校準或溫度校準）。

2. 耗材處理

• 廢棄反應板按生物危害廢物處理。

• 毛細管需妥善丟棄，避免劃傷。

3. 數據備份

• 將實驗結果備份至云端或外部存儲設備。

六、常見問題與解決方案

1. 無擴增信號

• 檢查試劑活性（如聚合酶是否失活）。

• 確認引物探針設計正確，模板質量合格。

2. 非特異性擴增

• 優化退火溫度或更換引物。

• 增加模板稀釋度減少抑制物影響。

3. 重復性差

• 檢查移液精度，確保反應體系均一。

• 避免模板降解或污染。

注意事項

• 分區操作：模板添加與主混合液配制需在不同區域進行。

• 避免頻繁打開反應板，防止氣溶膠污染。

• 定期驗證儀器性能，確保數據可靠性。

以上為羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR的標準操作流程，具體參數需根據實驗目的優化。