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免疫組化DAB法 顯示過氧化物酶

來源:上海源葉生物科技有限公司   2012年08月04日 13:45  

〔原理〕 過氧化物酶分解H2O2的過程中,下面反應(yīng)不直接發(fā)生:AH2(供氫體)+H2O2→A(供氫體的氧化物)+2H2O2實(shí)驗(yàn)可知,有稱為復(fù)合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物(受氫體)復(fù)合體生成,在復(fù)合體zui后分解為酶和水時,游離的原子氧使供氫體氧化而顯色。酶組織化學(xué)中所使用的供氫體應(yīng)是含有色原性基團(tuán)的發(fā)色物質(zhì),如奈酚和聯(lián)苯胺。
免疫組化染色步驟(以ABC法為例)
溶液的配置:
1. 0.1M PBS 2000ml:NaCL 18g, NaH2PO4·2H2O 0.8g, Na2HPO4·12H2O 12g. 共六份
2. 檸檬酸鹽緩沖液:
貯存液:0.1M檸檬酸溶液(A):21.01g 檸檬酸 + 1L 蒸餾水
0.1M檸檬酸三鈉溶液(B):29.41g 檸檬酸三鈉 + 1L 蒸餾水
工作液:9ml A液+41ml B液+450ml 蒸餾水→0.01M檸檬酸鹽緩沖液
3. 0.03% H2O2-甲醇:30% H2O2 0.4ml + 400ml 純甲醇→充分混勻
4. 20% 甘油:80ml 純甘油 + 320ml 蒸餾水
5. 稀釋抗體:1︰300 ,1︰400 ,1︰600 (臨用前配)
6. 酒精的配置
染色步驟:一步法
1. 載玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ,60℃ 20′(水浴箱中),二甲苯Ⅱ,室溫 15′。
3. 脫水,100%→95%→85%→75%酒精,每級均為3′。
4. 蒸餾水沖洗,PBS 5′﹡1
5. 微波爐修復(fù)抗原:0.01M 檸檬酸鹽緩沖液,99℃ 肺 20′,心腎 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O2-甲醇,室溫20′
8. PBS沖洗,PBS 3′*3,甩干或紙巾吸去多余液體(勿碰到組織),PAP Pen劃境線。
9. block solution 封閉抗原,室溫10′。
10. 傾出封閉液,不洗,滴加一抗(60ul),4℃過夜或37℃ 1~2h。
11. PBS沖洗,3′*3。
12. 除去PBS,滴加A增強(qiáng)劑,室溫25′。
13. PBS沖洗,3′*3。
14. 除去PBS,滴加B劑,室溫35′。
15. PBS沖洗,3′*3。同時配置DAB顯色劑。
16. 除去PBS,DAB顯色10′(在顯微鏡下觀察染色程度控制染色時間)。蒸餾水沖洗。
17. 復(fù)染:蘇目素均勻滴加2滴,40′′,蒸餾水沖洗,60℃溫水泡半分鐘。
18. 脫水:75%酒精→85%→95%→100%(3次),每級3′。
19. 透明:二甲苯Ⅰ3′,二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片:中性樹脂,加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡),60℃ 0.5h烘干。
結(jié)果:棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原X的定位。
拍照
1. 更換樣品時,除了調(diào)整焦距和視野外,顯微鏡上的其他部件都不能動!所有的樣品必須一次拍攝*。特別是在拍攝過程中,不要一會用高倍鏡,一會用低倍鏡,來回切換物鏡。
2. 數(shù)碼相機(jī)必須設(shè)置為手動曝光,并且保持每張照片用同樣的曝光條件,同樣的曝光時間,同樣的光圈。特別要注意的是,一定要將數(shù)碼相機(jī)的自動白平衡功能給關(guān)掉
3. 免疫組化切片一般染色不太深,因此拍攝出的照片顏色較淺,就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色,一般是相機(jī)自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃,也不偏藍(lán)。

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