本文要點(diǎn)：腸道屏障完整性的動(dòng)態(tài)變化與多種疾病的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)，對(duì)其精準(zhǔn)檢測(cè)與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)可為優(yōu)化治療方案提供關(guān)鍵信息。本研究開發(fā)了一種基于谷胱甘肽包裹金納米簇（Au-GSH）的雙功能策略，通過體內(nèi)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像與體外比色尿液分析相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腸道屏障完整性的無創(chuàng)檢測(cè)與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。經(jīng)口服后，Au-GSH的體內(nèi)分布行為可隨腸道屏障完整性狀態(tài)發(fā)生顯著改變：當(dāng)屏障受損時(shí)，其超小尺寸（低于腎小球?yàn)V過截留閾值）可選擇性滲透至膀胱，并通過尿液快速排出。這一過程可通過實(shí)時(shí)無創(chuàng)采集Au-GSH的NIR-II熒光信號(hào)（>1100 nm）進(jìn)行可視化追蹤。此外，基于Au-GSH的類過氧化物酶活性建立的比色尿液分析體系進(jìn)一步提升了檢測(cè)靈敏度與定量能力。實(shí)驗(yàn)表明，該策略成功檢測(cè)到潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠模型中典型的腸道屏障損傷特征，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)治療性及預(yù)防性干預(yù)模式下屏障修復(fù)過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。該技術(shù)為腸道屏障相關(guān)疾病的診斷與療效評(píng)估提供了新型研究方法。

動(dòng)物活體成像系統(tǒng)

本文通過簡(jiǎn)單的一步反應(yīng)，合成了具有近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光發(fā)射、腎臟排泄行為及類過氧化物酶活性的金-谷胱甘肽分子簇（Au-GSH）（圖1a），其可通過體內(nèi)NIR-II熒光成像與體外比色尿液分析同步實(shí)現(xiàn)腸道屏障完整性的無創(chuàng)檢測(cè)與監(jiān)測(cè)（圖1b）。值得注意的是，口服Au-GSH后，僅當(dāng)腸道屏障完整性受損時(shí)，Au-GSH才能高效滲透屏障進(jìn)入膀胱并通過尿液排出。這一過程可通過實(shí)時(shí)無創(chuàng)采集Au-GSH發(fā)射的>1100 nm的近紅外熒光信號(hào)進(jìn)行體內(nèi)NIR-II熒光成像可視化追蹤。基于Au-GSH的類過氧化物酶活性，進(jìn)一步建立了簡(jiǎn)易的尿液比色檢測(cè)方法以評(píng)估腸道屏障完整性，從而提升了檢測(cè)性能。此外，基于Au-GSH的NIR-II熒光成像與比色尿液分析策略成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)受損腸道屏障完整性修復(fù)過程的監(jiān)測(cè)，展現(xiàn)出在臨床實(shí)踐中評(píng)估腸道屏障完整性相關(guān)疾病預(yù)后的巨大潛力。

本文采用谷胱甘肽（GSH）作為封端劑，通過簡(jiǎn)單的一步還原法制備了Au-GSH。獲得Au-GSH后，開始評(píng)估其用于基于NIR-II熒光成像和比色尿液分析的腸道屏障完整性檢測(cè)與監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵特性。首先，分析了Au-GSH的光物理性質(zhì)。其紫外-可見-近紅外（UV–vis–NIR）吸收光譜（圖2a）顯示出一條延伸至900 nm的下降曲線，無特征峰，這與典型的金簇吸收特性一致。在808 nm波長激光激發(fā)下，發(fā)射光譜顯示Au-GSH在NIR-II窗口（1000–1400 nm，圖2a）內(nèi)發(fā)光，峰值位于1047 nm。良好的光穩(wěn)定性是體內(nèi)熒光成像的前提。

圖2. Au-GSH顯示出NIR-II熒光發(fā)射能力、快速腎臟排泄行為和過氧化物酶樣催化活性

鑒于GSH優(yōu)異的抗污能力可屏蔽內(nèi)源性蛋白質(zhì)吸附，且透射電鏡（TEM）圖像（圖2c）直觀證實(shí)Au-GSH超小尺寸（約4.5 nm，低于腎小球?yàn)V過截留閾值~5.5 nm），對(duì)Au-GSH具備快速腎臟排泄?jié)摿φ归_評(píng)估。通過靜脈注射Au-GSH后，在小鼠腹側(cè)進(jìn)行NIR-II窗口（>1100 nm）實(shí)時(shí)熒光成像（圖2d），結(jié)果顯示：注射后熒光信號(hào)迅速定位于膀胱，10分鐘開始顯著積累，1小時(shí)后膀胱信號(hào)減弱并伴隨尿液中NIR-II熒光出現(xiàn)。隨時(shí)間推移，膀胱部位熒光強(qiáng)度逐漸降低，6小時(shí)大部分消退，24小時(shí)消失。NIR-II成像直觀表明Au-GSH主要通過尿液排泄，其他組織無顯著蓄積。基于此，收集注射后24小時(shí)尿液分析排泄動(dòng)力學(xué)（圖2e），發(fā)現(xiàn)約85%的Au-GSH在此時(shí)間段內(nèi)排出，其中80%在6小時(shí)內(nèi)已清除（圖2f），證實(shí)其快速排泄特性及低體內(nèi)滯留毒性。

基于Au-GSH腎臟排泄行為及先前發(fā)現(xiàn)的納米金簇人工酶活性，本研究進(jìn)一步探索其類過氧化物酶催化活性，以期建立圖2g所示比色尿液分析方法，輔助NIR-II成像技術(shù)以提升腸道屏障完整性檢測(cè)性能。實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)Au-GSH與H?O?共存時(shí)，TMB溶液可由無色變?yōu)樗{(lán)色，并在652 nm處吸光度（A???）達(dá)到峰值（圖2h,i），表明Au-GSH催化H?O?產(chǎn)生活性羥基自由基（OH•）氧化TMB生成藍(lán)色產(chǎn)物，印證其酶活性。通過優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間、化合物（NaCl、H?O?）濃度及環(huán)境pH等條件，建立比色檢測(cè)體系，其催化活性與Au-GSH濃度呈強(qiáng)相關(guān)性（Pearson’s r=0.9987；圖2j）。隨后驗(yàn)證該方法的可行性：注射Au-GSH后1、3、12、24小時(shí)收集尿液，基于催化活性計(jì)算排泄量并與ICP-MS（金屬定量金標(biāo)準(zhǔn)）結(jié)果對(duì)比，顯示二者高度相關(guān)（Pearson’s r=0.7365），證實(shí)比色法可簡(jiǎn)便、定量且低成本檢測(cè)尿液中Au-GSH濃度（圖2k）。綜上，Au-GSH的快速腎臟清除行為可通過無創(chuàng)實(shí)時(shí)NIR-II成像及簡(jiǎn)易體外比色尿液分析精準(zhǔn)表征。

圖3. Au-GSH用于分析腸屏障完整性的可行性

之后進(jìn)一步探索其在評(píng)估腸道屏障完整性中的可行性。首先評(píng)估了Au-GSH的細(xì)胞生物相容性：將不同濃度的Au-GSH與不同細(xì)胞共孵育12或24小時(shí)后（圖3a,b），未觀察到細(xì)胞毒性，表明其適用于后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)。之后，評(píng)估了Au-GSH在模擬胃液（SGF）、模擬腸液（SIF）及全胃腸道消化條件（GI：SGF中2小時(shí)，隨后SIF中3小時(shí)）下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，不同條件下，Au-GSH的熒光強(qiáng)度僅減弱約10%（圖3c,d），且尺寸無明顯變化（圖3e及S8），證實(shí)其優(yōu)異的穩(wěn)定性。

為評(píng)估Au-GSH對(duì)腸道屏障完整性的表征能力，采用Transwell系統(tǒng)建立模擬腸道屏障的Caco-2單層模型（圖3f）。當(dāng)跨上皮電阻（TEER，評(píng)估Caco-2單層完整性的常用指標(biāo)）超過300 Ω·cm2時(shí)，形成完整的腸道屏障模型（IIB）。通過右旋葡聚糖硫酸鈉（DSS）處理IIB單層24小時(shí)誘導(dǎo)損傷，建立DSS損傷型腸道屏障（DIB），表現(xiàn)為TEER顯著降低。隨后，將Au-GSH分別加入IIB和DIB的頂側(cè)（AP，細(xì)胞層上方），并于基底外側(cè)（BL，半透膜下方）每20分鐘取樣（持續(xù)120分鐘），通過NIR-II熒光定量檢測(cè)透過單層的Au-GSH含量。結(jié)果表明：對(duì)于IIB，基底側(cè)樣品中未檢測(cè)到熒光，表明Au-GSH幾乎無法穿透完整屏障；而DIB的基底側(cè)樣品熒光隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)（圖3g），顯示Au-GSH可自由擴(kuò)散透過受損屏障。以上結(jié)果證明，Au-GSH的滲透行為與腸道屏障完整性密切相關(guān)，為其體內(nèi)評(píng)估腸道屏障狀態(tài)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

圖4. 基于Au-GSH的同時(shí)NIR-II熒光成像和比色尿液分析，用于精確檢測(cè)腸道屏障的完整性

利用上述已驗(yàn)證的Au-GSH優(yōu)勢(shì)，建立一種雙模式檢測(cè)策略，該策略同時(shí)實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)無創(chuàng)實(shí)時(shí)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像以及體外簡(jiǎn)單快速的比色尿液分析，以評(píng)估疾病狀態(tài)下腸道屏障完整性的變化（圖1b）。考慮到潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種以腸道屏障完整性缺陷為特征的炎癥性腸病，選擇其作為代表性疾病來展示該策略。建立了如圖4a所示的DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型以模擬UC。為了模擬不同程度的腸道屏障損傷，小鼠被均等分為三個(gè)不同組別：從第1天至第7天口服3% DSS（標(biāo)記為7天組）、從第3天至第7天口服3% DSS（標(biāo)記為5天組），以及全程飲用水（標(biāo)記為正常組），隨后在第8天口服Au-GSH進(jìn)行NIR-II熒光成像。同時(shí)，收集灌胃給藥后24小時(shí)內(nèi)排出的尿液，按照上述方法進(jìn)行比色尿液分析（圖2g–k）。

觀察到的顯著體重下降（圖4b）與疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）的明顯升高（圖4c）間接證實(shí)7天組UC模型成功建立。相較于7天組，5天組中觀察到的體重下降趨勢(shì)與DAI升高較為輕微，表明腸道屏障完整性僅受到微小損傷。令人欣喜的是，正常組與5天組小鼠經(jīng)Au-GSH給藥后僅腸道內(nèi)可清晰觀察到NIR-II熒光信號(hào)，而7天組小鼠在口服給藥后6–8小時(shí)不僅腸道內(nèi)顯現(xiàn)熒光，膀胱區(qū)域也出現(xiàn)顯著明亮熒光（圖4d）。肉眼可輕松捕捉到7天組小鼠尿液樣本使比色檢測(cè)溶液從無色迅速轉(zhuǎn)為藍(lán)色（圖4e,f），而正常組與5天組尿液樣本未引發(fā)變化，表明開發(fā)的比色尿液分析法無需儀器輔助即可簡(jiǎn)單快速區(qū)分疾病狀態(tài)、亞健康狀態(tài)與正常狀態(tài)，從而進(jìn)一步提升檢測(cè)精度。

如圖4g,h所示，正常組小鼠腸道呈現(xiàn)健康結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為完整的結(jié)腸上皮、緊密排列的腸隱窩及豐富的杯狀細(xì)胞。相比之下，7天組小鼠腸道黏膜嚴(yán)重受損，特征為腸隱窩分支、排列紊亂及杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，而5天組小鼠杯狀細(xì)胞減少程度較低，黏膜層與隱窩損傷較輕，顯示損傷模式較輕微。基于上述研究，通過免疫熒光染色評(píng)估各組小鼠腸道中緊密連接蛋白（作為腸黏膜上皮細(xì)胞間主要連接結(jié)構(gòu)，對(duì)維持腸道屏障機(jī)械完整性與正常功能至關(guān)重要）的表達(dá)水平。如圖4i–l所示，7天組緊密連接蛋白（即occludin，圖4j；ZO-1，圖4l）表達(dá)水平顯著低于5天組與正常組，直接證實(shí)了腸道屏障完整性的破壞。綜合結(jié)果表明，基于Au-GSH的比色尿液分析法能夠以簡(jiǎn)便、定量且經(jīng)濟(jì)高效的方式精準(zhǔn)檢測(cè)腸道屏障完整性的動(dòng)態(tài)變化。

圖5. 通過NIR-II熒光成像和比色尿檢精確監(jiān)測(cè)腸屏障恢復(fù)的進(jìn)展

為進(jìn)一步探索該策略在腸道屏障完整性修復(fù)監(jiān)測(cè)中的潛力，首先建立潰瘍性結(jié)腸炎（UC）治療模型：小鼠連續(xù)7天口服3% DSS后，分別接受5-氨基水楊酸（一線治療藥物ASA）治療3天或7天（標(biāo)記為3天-ASA組與7天-ASA組），并通過NIR-II熒光成像與比色尿液分析全程監(jiān)測(cè)修復(fù)進(jìn)程（圖5a）。未接受ASA或DSS處理的小鼠分別作為模型組與正常組。結(jié)果顯示，所有3% DSS處理小鼠均出現(xiàn)體重下降（圖5b）、DAI升高（圖5c）、便血腹瀉等癥狀，證實(shí)UC模型成功構(gòu)建。ASA治療后，與模型組相比，治療組體重回升與DAI下降顯著改善（圖5b,c），其中7天-ASA組恢復(fù)效果更顯著（p < 0.001），表明腸道屏障修復(fù)程度隨時(shí)間延長而增強(qiáng)。NIR-II熒光成像與尿液比色分析顯示，ASA治療后腸道至膀胱的Au-GSH分布量減少，直觀反映屏障完整性逐漸恢復(fù)（圖5d）。該方法成功區(qū)分不同療程（0、3、7天）的修復(fù)效果：隨著治療時(shí)間延長，尿液比色讀數(shù)逐步降低并趨近正常組水平（圖5e,f）。推測(cè)短期治療（3天）僅部分修復(fù)屏障缺陷，導(dǎo)致部分Au-GSH仍可穿透進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；而7天治療則有效阻斷Au-GSH入血，提示屏障功能接近恢復(fù)。利用H&E染色（圖5g）與AB-PAS染色（圖5h）結(jié)果與NIR-II熒光成像和比色尿液分析對(duì)比（圖5d–f）高度吻合，證實(shí)該策略可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腸道屏障完整性的動(dòng)態(tài)修復(fù)進(jìn)程。

圖6. 分析UC預(yù)防模式下腸道屏障完整性的變化

如圖6a所示，實(shí)驗(yàn)將小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組與AFP組（圖6b,c）。Au-GSH給藥后，NIR-II熒光成像顯示小鼠胃腸道出現(xiàn)顯著信號(hào)。值得注意的是，給藥4小時(shí)后，模型組小鼠膀胱與腸道均檢測(cè)到熒光信號(hào)，而正常組與AFP組熒光信號(hào)僅局限于腸道區(qū)域（圖6d），表明AFP有效抑制DSS引發(fā)的腸道屏障破壞。比色尿液分析進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論：模型組尿液加入顯色劑后快速變?yōu)樗{(lán)色（源于Au-GSH存在），而AFP組與正常組尿液未發(fā)生明顯顏色變化（圖6e,f）。該結(jié)果與熒光成像數(shù)據(jù)一致，證明AFP通過維持腸道屏障完整性發(fā)揮UC預(yù)防作用。H&E染色（圖6g）與AB-PAS染色（圖6h）結(jié)果表明，模型組結(jié)腸黏膜損傷嚴(yán)重且杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少；而AFP組黏膜與隱窩結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，杯狀細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)至接近正常水平，有效維持了腸道屏障完整性。該結(jié)論與NIR-II熒光成像及比色尿液分析結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了AFP的UC預(yù)防作用。

本研究提出了一種基于Au-GSH的整合式診斷策略，通過活體實(shí)時(shí)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像與外周快速比色尿液分析的無創(chuàng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了腸道屏障完整性的精準(zhǔn)檢測(cè)與動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。Au-GSH在胃腸道及復(fù)雜生理環(huán)境中均展現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性，其可在>1100 nm的NIR-II窗口發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào)，并具有類過氧化物酶活性。當(dāng)腸道屏障完整時(shí)，Au-GSH被限制于腸腔內(nèi)；而當(dāng)屏障受損時(shí)，其憑借小于腎排泄閾值（~4.5 nm）的粒徑可穿透腸壁進(jìn)入血液循環(huán)并經(jīng)腎臟快速排出。基于Au-GSH的酶活性特性，本研究開發(fā)了直接通過尿液顯色反應(yīng)評(píng)估腸道屏障狀態(tài)的比色檢測(cè)方法。該方法通過肉眼可辨的顏色信號(hào)拓寬了應(yīng)用場(chǎng)景，同時(shí)提升了檢測(cè)精度。Au-GSH優(yōu)異的生物相容性進(jìn)一步驗(yàn)證了其臨床轉(zhuǎn)化潛力。該策略成功應(yīng)用于UC小鼠模型中不同損傷程度的腸道屏障狀態(tài)區(qū)分與表征，為腸道屏障完整性相關(guān)疾病的診斷提供了新型整合式平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)

Zhang L, Feng L, Yang L, et al. Noninvasive Detection and Monitoring of the Integrity of the Intestinal Barrier through NIR-II Fluorescence Imaging and Colorimetric Urinalysis[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2025, 17(9): 13445-13460.

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動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

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