PCR技術(shù)是什么？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱(chēng)為PCR，是分子生物學(xué)技術(shù)之一。20世紀(jì)70年代，研究人員報(bào)道了使用合成引物和DNA聚合酶從模板復(fù)制單鏈DNA。然而，直到1983年，Kary Mullis才發(fā)明出用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA的研究工具，就是我們今天所熟知的PCR方法。從此以后，PCR成為分子生物學(xué)研究的一部分，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測(cè)和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。而Kary Mullis也因這一發(fā)明獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( PCR ) 是從目標(biāo)序列中生成數(shù)百萬(wàn)拷貝核酸的過(guò)程。科學(xué)家已運(yùn)用 PCR 儀 (也稱(chēng)為熱循環(huán)儀) 復(fù)制了這種反應(yīng)。了解 PCR 儀自 20 世紀(jì) 80 年代面世以來(lái)的歷史，以及有助于改善 PCR 結(jié)果的 PCR 技術(shù)進(jìn)步。

PCR的原理

PCR是一種能夠在短時(shí)間內(nèi)將單個(gè)DNA分子擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍的生化過(guò)程。其擴(kuò)增過(guò)程包括三個(gè)連續(xù)步驟：

（1）變性，對(duì)雙鏈DNA模板進(jìn)行加熱，使其解離；

（2）退火，被稱(chēng)為引物的短DNA分子與目標(biāo)DNA的側(cè)翼區(qū)域結(jié)合；

（3）延伸，DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進(jìn)行延伸。將這些步驟重復(fù)（“循環(huán)”）25-35次，即可按指數(shù)方式獲得精確的目標(biāo)DNA拷貝（圖1）。

多年以來(lái)，PCR的基本原理一直未變，但隨著 DNA聚合酶和試劑性能的大幅提升，以及儀器和塑料耗材的不斷創(chuàng)新，PCR實(shí)驗(yàn)方法也在不斷改進(jìn)。

圖 1.PCR的三個(gè)步驟——變性、退火和延伸——如第一個(gè)循環(huán)所示，目標(biāo)DNA隨重復(fù)循環(huán)而發(fā)生指數(shù)擴(kuò)增。

DNA聚合酶

DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補(bǔ)鏈。所有DNA聚合酶都具有 5′→ 3′ 聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸（圖 2）。

早期的PCR，通常使用來(lái)源于 大腸桿菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 來(lái)生成新的子鏈。但是，這種 大腸桿菌酶對(duì)熱敏感，易受到變性階段高溫度的破壞，從而無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行退火和延伸步驟。因此，需要在全程每個(gè)循環(huán)的退火步驟中重新補(bǔ)充酶。

熱穩(wěn)定DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是一項(xiàng)重大進(jìn)步。它實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間的反應(yīng)穩(wěn)定性，為PCR方法的改進(jìn)提供了無(wú)限可能。1976年，從耐熱菌 Thermus aquaticus 中分離出來(lái)的Taq DNA 聚合酶是最有名的熱穩(wěn)定DNA聚合酶之一。1988年研究人員報(bào)道，證明 Taq DNA 聚合酶能夠在 75°C以上保持活性，從而無(wú)需手動(dòng)加入新鮮的酶即可持續(xù)循環(huán)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了工作流程自動(dòng)化。此外，與 大腸桿菌 DNA聚合酶相比， Taq DNA 聚合酶能夠獲得更長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增子，并且具有更高的靈敏度、特異性和得率。也因此， Taq DNA 聚合酶被 《科學(xué)》 雜志評(píng)為1989年的“年度分子”。

盡管 Taq DNA 聚合酶大大改善了PCR實(shí)驗(yàn)方法，但也表現(xiàn)出一些缺點(diǎn)。例如，TaqDNA 聚合酶在90°C以上的DNA鏈變性溫度中相對(duì)不穩(wěn)定。對(duì)于需要更高解離溫度的富含GC和/或具有強(qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA模板而言，這一問(wèn)題尤為明顯。同時(shí)， Taq DNA 酶還缺乏校正活性，會(huì)在擴(kuò)增期間引入錯(cuò)誤核苷酸。對(duì)于克隆和測(cè)序而言，序列的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，所以不能存在含有錯(cuò)配的PCR擴(kuò)增子。此外， Taq DNA 聚合酶的易錯(cuò)配特性使其通常無(wú)法穩(wěn)定擴(kuò)增長(zhǎng)度大于5 kb的片段。為克服這些缺點(diǎn)，性能更好的DNA聚合酶不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)，使PCR在廣泛的生物學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮其強(qiáng)大的功能。

圖 2：DNA聚合酶沿5′至3′方向使PCR引物延伸。

PCR熱循環(huán)儀

熱循環(huán)儀是一種能夠?yàn)?/span>PCR反應(yīng)自動(dòng)完成溫度循環(huán)和孵育的儀器。在引入熱循環(huán)儀之前，PCR反應(yīng)是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程，需在不同溫度的水浴之間轉(zhuǎn)移樣品，并為每個(gè)步驟需要精確定時(shí)。熱循環(huán)儀和 Taq DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)，讓PCR的自動(dòng)化成為現(xiàn)實(shí)。第一款自動(dòng)化PCR熱循環(huán)儀是在1985年由PerkinElmer和Cetus以合資方式引入市場(chǎng)的。此后， 熱循環(huán)儀 的實(shí)用性、設(shè)計(jì)、溫度控制和循環(huán)速度不斷得到改善。熱循環(huán)儀也為 定量PCR儀 的開(kāi)發(fā)開(kāi)拓了道路，定量PCR儀將PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物累積的實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)合在一起。

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