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HPLC 提升分離度,Poroshell 120 4μm 有的放失

來源:安捷倫科技(中國)有限公司   2025年05月27日 14:22  

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目前,在常規色譜方法中,使用長度為 250mm 或 150mm、粒徑為 5μm 的色譜柱時,通常會遇到分離度稍有欠缺不能滿足系統適應性要求的問題。那么,在不改變原有色譜方法、保持色譜固定相相同或相近選擇性的情況下,能否還有方法改善分離度?

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提高柱效是改善分離度的關鍵

分離度(Rs)的好壞,與色譜柱柱效(N)、選擇性(α)、保留因子(k)有關, 見分離度公式。在保持相同的選擇性 α(流動相條件、柱溫、固定相等)和相同色譜柱尺寸的條件下,提高柱效是改善分離度的關鍵。

分離度(Rs)公式:

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提高柱效的方法:


?降低色譜填料顆粒的粒徑

?

提高化合物在填料顆粒微孔中的傳質效率

?

使用顆粒粒度更加均勻的填料

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如何提高柱效?是否會超出藥典規定范圍要求?

現行美國藥典 USP 通則<621>中對色譜柱尺寸變化的要求是:填充劑粒徑(dp)和柱長(L)的比例關系 L/dp 值或( N 值)應在原有數值的 -25%~+50% 范圍內。藥典色譜柱尺寸調整后方法參數允許調整的范圍也是 L/dp 值或( N 值)在 -25%~+50% 范圍內。

分析實踐工作中,可以保持柱長(L)不變,通過降低粒徑(dp)的辦法,提升柱效,達到分離度改善的結果。以通用的 4.6*250mm 色譜柱為例,不同粒徑色譜的 L/dp 計算結果見表 1 。

表 1. 不同粒徑色譜柱 L/dp 值及壓力倍數計算結果
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*備注:壓力倍數是以 5μm 粒徑色譜柱為基準,根據壓力與粒徑的平方成反比的關系計算。

從表 1 結果可見,柱長和內徑保持不變,使用 4μm 和 3.5μm 色譜柱時,都可以滿足 L/dp 值的變化在 -25% 到 +50% 范圍內。不過,當選擇更小粒徑色譜柱時,需要考慮壓力的問題。

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從 5μm 到 4μm,柱效提高到 2 倍

通常表面多孔型填料能滿足上述對柱效提高的需求,更多內容參考 Agilent 相關資料。Poroshell 4μm 粒徑色譜柱的柱效(N)相當于相同尺寸全多孔 5μm 粒徑的兩倍,可以利用這一點來改善常規色譜方法的分離度。從分離度公式計算,在其它條件不變的情況下,兩倍柱效的提升可以提高到 1.4 倍的分離度(理論值)。這對現有方法分離度不佳或者限制于壓力問題不能使用更小粒徑(如3μm)色譜柱的應用來說,1.4 倍分離度的貢獻是非常有用的。

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圖 1. Agilent InfinityLab Poroshell 120 色譜柱

例如,某標準方法中,使用 Zobax SB-C18 4.6*250mm 5μm 色譜柱,關鍵組分的分離度只有 1.2。從分離度改善的角度,選擇了高效傳質、填料顆粒大小均勻的 4μm Poroshell 120 SB-C18 色譜柱,所有色譜方法均不改變,其分離度達到了 1.5 以上。

目前,粒徑為 4μm 的 Poroshell 色譜柱包括:

?封端的 EC-C18、C8

?

能耐低 pH、不封端的 SB-C18 柱

?

能耐高 pH 體系的 HPH-C18 和 C8 柱

?

特殊選擇性的苯基己基(Phenyl-Hexyl)、五氟苯基(PFP)、SB-Aq 以及用于強極性化合物分析的 HILIC 固定相( HILIC 和 HILIC-Z)

尤其是常用的 C18 柱,當原方法使用 Zorbax SB-C18 或 Plus/XDB-C18 時,可以非常方便地轉換到對應的 Poroshell 色譜柱上,而不需要對方法進行調整。

實際應用案例分享

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應用案例 1:


機動車檢驗標志電子化

方法要求分離度 Rs>11.5。當使用相同尺寸的 Poroshell 4μm 色譜柱時,柱效有將近一倍的提升,分離度提升 1.23 倍。在進行溶出分析或者其它快速中控分析時,選擇這樣的色譜柱可以適當減少柱長,達到快速分析的目的。如案例中使用 100mm 長的色譜柱,分離度和柱效依然滿足藥典要求。

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圖 2. 萘普生片含量測定-USP 方法結果

應用案例 2:


苯扎貝特有關物質分析

方法中換成相同尺寸 Poroshell 4μm 色譜柱后,不僅分離度提升,而且柱效和靈敏度都有提升。

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圖 3. 苯扎貝特有關物質的檢測結果

應用案例 3:


三七皂苷的分析

所用分析方法不變,僅將所用色譜柱改為4μm Poroshell色譜柱,Rg1和Re的分離度從1.51提高到了2.31。柱效更高、壓力適中的色譜柱,用于建立耐用的中藥成分含量測定方法非常實用。

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圖 4. 三七皂苷的含量測定結果:Poroshell 120 4µm vs. 全多孔 5µm

應用案例 4:


穿黃制劑定性指紋圖譜及多組分含量測定方法研究

該研究對流動相、柱溫、色譜柱等進行了選擇和優化,最后確定使用 Poroshell 120 EC-C18, 4.6 x 250 mm, 4 µm 色譜柱,無論指紋圖譜還是多組分含量測定都非常完美。

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圖 5. 17 批穿黃制劑指紋圖譜疊加圖:1-新綠原酸;2-綠原酸;3-隱綠原酸;4-異綠原酸B;5-異綠原酸A;7-異綠原酸C;8-穿心蓮內酯;9-新穿心蓮內酯;10-去氧穿心蓮內酯;11-脫水穿心蓮內酯

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圖 6. 穿黃制劑 HPLC 指紋圖譜共有模式

4μm Poroshell 120 的優勢和應用:





替代5µm全多孔色譜柱時,滿足藥典 L/dp 變化要求


與5µm全多孔填料相比,約有 1 倍柱效提升


提供多種固定相類型


200-400bar 的 HPLC 儀器都能用


含量測定、溶出、快速分析


化藥有關物質檢查、中藥特征圖譜研究

 

安捷倫 2025 618 預售

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Poroshell 120 4μm 系列色譜柱

 

ValueLab 液相柱

單根 59 折,3根組合 53 

 

 

 

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