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如何提高電泳結(jié)果的條帶分辨率?

來源:上海易匯生物科技有限公司   2025年05月21日 15:33  

如何提高電泳結(jié)果的條帶分辨率?

提高電泳結(jié)果的條帶分辨率,可以從凝膠制備、樣品處理、電泳過程控制以及染色檢測等多個(gè)環(huán)節(jié)入手,具體方法如下:

凝膠制備方面

  • 選擇合適的凝膠濃度:不同濃度的凝膠適用于分離不同分子量范圍的生物大分子。一般來說,分離較小分子量的蛋白質(zhì)或核酸,需要使用較高濃度的凝膠;而分離較大分子量的物質(zhì),則適合用較低濃度的凝膠。例如,分離分子量較小的寡核苷酸,可選用 12% - 20% 的聚丙烯酰胺凝膠;分離分子量較大的基因組 DNA,常使用 0.7% - 1.0% 的瓊脂糖凝膠。

  • 優(yōu)化凝膠聚合條件:凝膠聚合的均勻性對(duì)條帶分辨率至關(guān)重要。要確保聚合試劑的純度和活性,按照正確的比例配制凝膠溶液。在聚合過程中,溫度和時(shí)間要控制得當(dāng),通常在室溫下讓凝膠自然聚合,避免溫度過高或過低導(dǎo)致凝膠孔徑不均勻。同時(shí),要注意避免凝膠中出現(xiàn)氣泡,因?yàn)闅馀輹?huì)破壞凝膠的連續(xù)性,影響分子的遷移。

樣品處理方面

  • 充分變性和分離:對(duì)于蛋白質(zhì)樣品,在處理時(shí)要加入足夠的變性劑(如 SDS)和還原劑(如 β - 巰基乙醇),使蛋白質(zhì)充分變性并打開二硫鍵,形成線性分子,以保證其在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。對(duì)于核酸樣品,可通過加熱或加入變性劑等方法使其變性,防止形成二級(jí)結(jié)構(gòu)或高級(jí)結(jié)構(gòu),影響電泳遷移率。

  • 控制樣品濃度和體積:樣品濃度過高會(huì)導(dǎo)致條帶拖尾、分辨率降低,而過低則會(huì)使條帶信號(hào)微弱。因此,需要通過準(zhǔn)確的定量方法確定合適的樣品濃度,一般蛋白質(zhì)樣品的上樣濃度在 0.5 - 2 μg/μL,核酸樣品在 50 - 200 ng/μL 較為合適。同時(shí),上樣體積也不宜過大,以免超過樣品槽的容量或使條帶過度擴(kuò)散,一般不超過樣品槽體積的 2/3。

電泳過程控制方面

  • 選擇合適的電泳緩沖液:不同的電泳體系需要使用相應(yīng)的緩沖液,以維持穩(wěn)定的 pH 值和離子強(qiáng)度。例如,SDS - PAGE 電泳常用 Tris - 甘氨酸緩沖液,其 pH 值為 8.3 左右,能保證蛋白質(zhì)在電泳過程中帶有穩(wěn)定的負(fù)電荷。緩沖液的離子強(qiáng)度也會(huì)影響電泳效果,離子強(qiáng)度過高會(huì)產(chǎn)生大量熱量,導(dǎo)致凝膠變形;過低則會(huì)使電泳速度減慢,條帶擴(kuò)散。

  • 優(yōu)化電泳參數(shù):包括電壓、電流和電泳時(shí)間等。在電泳開始時(shí),可以采用較低的電壓或電流,使樣品在凝膠中緩慢進(jìn)入并分布均勻,然后再逐漸升高電壓或電流,以提高分離速度。但要注意避免電壓或電流過高,導(dǎo)致條帶變形或過熱。電泳時(shí)間要根據(jù)樣品的分子量大小和凝膠的長度來確定,一般來說,分子量較小的樣品需要較短的電泳時(shí)間,而分子量較大的樣品則需要較長的時(shí)間,以保證不同分子量的物質(zhì)能夠充分分離。例如,在分離分子量為 10 - 100 kDa 的蛋白質(zhì)時(shí),通常在 100 - 150 V 的電壓下電泳 1 - 2 小時(shí)。

染色和檢測方面

  • 選擇合適的染色方法:根據(jù)樣品的類型和檢測目的選擇合適的染色劑。例如,考馬斯亮藍(lán)染色法適用于蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測,靈敏度較高,能檢測到微克級(jí)的蛋白質(zhì);銀染法的靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色法更高,可檢測到納克級(jí)的蛋白質(zhì),但操作相對(duì)復(fù)雜,且成本較高。對(duì)于核酸的檢測,常用溴化乙錠(EB)染色,它能嵌入到核酸的雙鏈結(jié)構(gòu)中,在紫外光下發(fā)出熒光,檢測靈敏度較高,但 EB 具有致癌性,使用時(shí)需注意安全。也可以選擇一些無毒的核酸染色劑,如 SYBR Green 等。

  • 優(yōu)化染色和脫色條件:染色時(shí)間和溫度要適當(dāng),一般考馬斯亮藍(lán)染色需要將凝膠浸泡在染色液中 1 - 2 小時(shí),在室溫下進(jìn)行即可。染色后需要進(jìn)行脫色處理,以去除背景顏色,使條帶更加清晰。脫色液通常為含有乙醇和乙酸的水溶液,脫色時(shí)間可能需要數(shù)小時(shí)甚至過夜,期間要更換幾次脫色液,直到背景顏色較淺,條帶清晰為止。對(duì)于銀染和 EB 染色等,也需要按照相應(yīng)的操作規(guī)程進(jìn)行染色和脫色處理,以獲得最佳的檢測效果。




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