小鼠肝星狀細胞永生化細胞專用培養基的操作需嚴格遵循無菌規范,以確保細胞活性和實驗數據的可靠性。以下為關鍵注意事項的補充說明:
**培養基預處理**
解凍后的培養基需在4℃避光保存,使用前應恢復至室溫(25±2℃),避免溫度驟變導致蛋白沉淀。若發現絮狀物,需立即以1000rpm離心5分鐘去除雜質,切勿直接過濾,以防生長因子損失。
**補液策略優化**
換液時建議保留原培養基30%-50%,尤其在高密度培養階段(細胞融合度>80%),可減少細胞應激。添加5mM谷氨酰胺增強劑時,需分次混勻(每次添加1ml震蕩10秒),避免局部濃度過高。
** 氣體平衡控制**
使用三氣培養箱(5% CO?/5% O?/90% N?)時,需預先平衡培養基2小時,pH值穩定在7.4±0.2。開放式操作需在厭氧工作站內完成,單次暴露時間不超過3分鐘。
** 污染監測方案**
每周用0.1μm孔徑濾膜過濾儲備液,并采用PCR法檢測支原體(建議選用16S rRNA通用引物)。若細胞出現偽足回縮等異常形態,可添加1%雙抗-抗真菌復合劑(含兩性霉素B 2.5μg/ml)應急處理。
** 凍存適配調整**
使用該培養基制備凍存液時,需將DMSO濃度降至8%,并添加10%海藻糖作為低溫保護劑。程序降溫階段應以-1℃/min速率降至-80℃,再轉入液氮保存。
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