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細胞培養的基本知識

來源:上海研謹生物科技有限公司   2025年05月14日 15:21  

細胞培養的基本知識

 

操作前準備工作:

1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒1402小時以上;

2.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈,紫外線照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時以上;

3.培養基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養基內,用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置-20度保存;

4.消化液(pH7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度保存;

5.各種凍存的液體復溫時應邊搖邊融化,否則有的液體(特別是培養基)容易產生沉淀;

6.培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上,如有高溫滅菌的應按程序來菌)至少每月一次;

7.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,然后用75%酒精擦拭,操作時注意無菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數量較多,培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒,開開后應用燈先燒口,然后燒蓋用完后同樣操作,整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。

 

復蘇:

1.應遵守慢凍快融的原則,先將水溫鍋調至37-37.5度,取出凍存的細胞迅速放入后交細胞面浸至水面以下不斷搖動至融化;

2.在無菌臺內將完全培養基加入50ml的小培養瓶內,約5ml左右,然后用無菌吸管從凍存管內取出細胞,置培養并內輕輕搖晃,使細胞均勻后置培養箱內培養。

 

傳代:

1.貼壁細胞:

對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,吸的越干凈越好,以免中和后加入的消化液,使強度減弱,50ml培養瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據配制強度經驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落后,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml完全培養基后,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然后分置其它無菌培養瓶內,加入完全培養基后繼續培養或實驗。

2.懸浮細胞:

一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內,加入完全培養基繼續培養,如要高濃度可先離心500rpm5min后加入完全培養基,輕輕吹勻后,分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養。

 

無菌操作:

簡要介紹:

1.將試驗用品放入超凈工作臺用紫外線照射30分鐘;2. 照射30分鐘后,進入緩沖間,換滅菌的無菌衣,換專用拖鞋;3.手部用5%的潔爾滅浸泡2分鐘,進入潔凈區后,用75%的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。4.最好戴口罩;5.操作時盡量靠近火焰;6.裝培養基的瓶子等不要直接口向上,用一個架子斜放,瓶口朝向火焰;7.標準操作,不要讓無菌吸管到處碰來碰去;8.中途出入無菌室,再次操作時,一定要再次用75%的酒精棉球消毒。

 

活細胞計數:

1、先消化吹打使細胞盡量變成單細胞懸液;

2、取出細胞液按你的濃度加入臺盼蘭置室溫5分鐘左右;

3、準備好潔凈的計數板及蓋玻片放在一旁,用玻璃滴管吸取染好并輕輕吹勻的細胞液,將滴管尖端輕輕靠在蓋玻與計數板的縫隙間,微微捏一下滴管膠頭細胞自動就被吸到計數板里了(捏重了細胞不均勻,計數不準,細胞還會流出)。

4、在鏡下計數。

四角的4個大方格內細胞總數÷4×10000=你滴入時細胞液每ml的細胞數。

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