一、凍存原理：對抗低溫損傷的三大機制?

1. ?冷凍保護劑：細胞的“生命盾-牌”?

作用機理?

DMSO（二甲基亞砜）或甘油作為滲透性保護劑，穿透細胞膜后：

降低細胞內水分冰點，抑制冰晶形成

與水分子形成氫鍵，延緩結晶速率

穩定膜脂質結構，防止低溫破裂

濃度選擇?

常規使用5%-10%濃度，高濃度（如20%）可能引發毒性，需平衡保護效果與細胞損傷。

2. ?程序降溫：精準控制冰晶生長?

相變危險區?（-15℃至-60℃）：此階段冰晶最易形成，需以?1℃/min?速率緩慢降溫，避免大冰晶刺穿細胞器。

玻璃化冷凍?：超快速降溫（>1000℃/min）使細胞內外形成無定形玻璃態，需搭配高濃度保護劑（如30% DMSO+蔗糖）。

3. ?低溫儲存：代謝暫停的關鍵?

-80℃?：短期保存（6-12個月），細胞內仍存微量代謝活動。

液氮（-196℃）?：長期保存（數十年），細胞進入完-全休眠狀態。

二、標準化操作流程（附避坑指南）?

實驗前準備?

材料清單?

凍存液（基礎培養基+20%血清+10% DMSO）

程序降溫盒（或異丙醇梯度盒）

凍存管（標記耐低溫標簽）

離心機、倒置顯微鏡

細胞預處理?

凍存前24小時換液，確保細胞處于?對數生長期?（貼壁細胞融合度80%-90%）

支原體檢測陰性（避免污染整個細胞庫）

(1) 細胞消化與收集?

棄培養基，PBS輕柔沖洗2次（去除血清抑制酶活性）

加入0.25%胰酶（含EDTA）消化，37℃孵育?2-5分鐘?（鏡下觀察細胞間隙擴大后立即終止）

加入含血清培養基中和酶，吹打成單細胞懸液

離心條件?：1000rpm × 5分鐘，去上清（殘留胰酶會損傷細胞）

(2)凍存液配制?

黃金配比?：70%基礎培養基 + 20%血清 + 10% DMSO

避坑要點?：

 DMSO需預冷至4℃，現配現用（防止降解產生毒性）

采用?梯度混合法?：先混合培養基與血清，逐滴加入DMSO，避免滲透壓劇烈變化

(3)分裝與標記?

細胞密度?：貼壁細胞1×10? ~ 5×10?/mL，懸浮細胞加倍

分裝量?：1-1.5mL/管，預留1/4空間防凍裂

標識規范?：

細胞名稱、代次、凍存日期（如Hela-p53+/+_P15_20231001）

使用耐低溫記號筆或激光雕刻（普通標簽易脫落）

(4)程序降溫?

常規程序?：

① 4℃預冷15分鐘

② 程序降溫盒轉移至-80℃冰箱過夜（降溫速率約1℃/min）

③ 24小時內移入液氮氣相（-150℃至-196℃）

無程序盒替代方案?：

將凍存管包裹棉花，置于泡沫盒中-80℃過夜，但存活率可能下降10%-20%

 三、凍存成敗的5大關鍵指標?

 四、常見問題與解決方案?

 復蘇后細胞大量死亡?

可能原因：DMSO毒性（暴露超30分鐘）、降溫速率不當

對策：解凍后立即離心換液，檢查程序盒降溫曲線

凍存管破裂?

預防：分裝量不超過凍存管容積3/4，使用厚壁凍存管

液氮罐污染?

處理：每月用10%過氧乙酸熏蒸罐體，凍存管密封前酒精擦拭