在細胞生物學研究中，對活細胞進行熒光標記和染色是觀察細胞生理狀態、檢測細胞活性以及分析細胞群體中活死細胞比例的重要手段。Calcein AM作為一種低細胞毒性的熒光染料，為這些研究提供了一種高效且可靠的解決方案。

一、Calcein AM 的熒光特性與工作原理

Calcein AM是一種常用的活細胞熒光標記試劑，其激發波長為490 nm，發射波長為515 nm，屬于綠色熒光范圍。該染料能夠穿透活細胞的細胞膜進入細胞內部，在細胞內由酯酶剪切，轉化為具有強綠色熒光的Calcein。Calcein由于其極性增強而被滯留在細胞質中，從而實現對活細胞的標記。Calcein AM的這一特性使其成為細胞活性檢測的理想選擇，因為它能在不影響細胞正常生理功能的前提下，對活細胞進行熒光標記。

在細胞膜完整性的活細胞中，Calcein AM的細胞毒性很低，不會干擾細胞的正常代謝活動。這使得Calcein AM不僅可以用于短期的細胞觀察，還適用于長時間的細胞培養和實驗檢測。Calcein AM的熒光信號強度與細胞內的酯酶活性相關，因此也可以間接反映細胞的代謝狀態和活性水平。在細胞凋亡或壞死過程中，細胞膜的完整性遭到破壞，Calcein AM無法進入細胞或細胞內的酯酶活性降低，導致熒光信號減弱或消失，這為檢測細胞活力和篩選具有細胞毒性化合物提供了便利。

二、Calcein AM 與 PI 雙重染色的解決方案

Calcein AM常與PI（碘化丙啶）結合使用，實現活細胞和死細胞的雙重染色。PI是一種核酸染料，不能穿透活細胞的完整細胞膜，但能與死細胞或細胞膜受損的細胞中的DNA結合，發出紅色熒光。Calcein AM標記活細胞產生綠色熒光，PI標記死細胞產生紅色熒光，二者結合使用可以在熒光顯微鏡下清晰地鑒別和定量分析活細胞與死細胞的比例。

在進行雙重染色時，首先將Calcein AM和PI分別加入細胞培養體系中，按照各自的推薦濃度進行孵育。Calcein AM通常的使用濃度為1 - 10 μM，PI的使用濃度一般為1 - 10 μg/mL。孵育時間一般為15 - 30分鐘，具體時間需根據細胞類型和實驗需求進行優化。孵育完成后，使用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測。在熒光顯微鏡下，活細胞顯示綠色熒光，死細胞顯示紅色熒光；在流式細胞儀中，可以通過設置相應的熒光檢測通道，分別收集綠色和紅色熒光信號，實現對活細胞和死細胞的定量分析。這種雙重染色方法廣泛應用于細胞毒性檢測、藥物篩選、細胞生物學研究等領域。通過精確分析活死細胞比例，研究人員可以評估化合物的細胞毒性、細胞培養的狀態以及細胞對各種刺激的響應。

三、Calcein AM 的操作使用方法

染色前準備

在進行Calcein AM染色之前，需要準備好細胞樣本。對于貼壁細胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細胞，然后用適當的緩沖液洗滌細胞，去除殘留的培養基成分。對于懸浮細胞，直接收集細胞并進行洗滌。將細胞調整到合適的濃度，一般為1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續的染色和檢測。

染色過程

將準備好的細胞與Calcein AM染色液混合，Calcein AM的常用工作濃度為1 - 10 μM。將混合后的細胞懸液置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育15 - 30分鐘。在孵育過程中，Calcein AM會穿透細胞膜進入細胞內部，被細胞內的酯酶剪切轉化為Calcein，產生綠色熒光。

染色后處理

孵育完成后，對于某些實驗，可能需要去除未進入細胞的Calcein AM，以減少背景熒光。可以使用適當的緩沖液對細胞進行洗滌，但需注意操作輕柔，避免細胞損失。將處理后的細胞懸液或細胞涂片置于熒光顯微鏡下觀察。在熒光顯微鏡下，活細胞會發出明亮的綠色熒光，細胞質中均勻分布著熒光信號。對于流式細胞儀檢測，將染色后的細胞懸浮在適當的緩沖液中，進行流式細胞儀分析，通過設置488 nm的激發波長和515 nm左右的發射波長檢測通道，收集綠色熒光信號，實現對活細胞的定量分析。

四、Calcein AM 的應用案例與研究成果

Calcein AM已被廣泛應用于多種研究領域。在細胞毒性檢測中，科研人員利用Calcein AM與PI雙重染色，結合流式細胞儀分析，評估了多種化合物對細胞的毒性作用，為藥物研發和毒性篩選提供了重要數據支持。在細胞生物學研究中，Calcein AM用于標記活細胞，觀察細胞的遷移、增殖和代謝活動，揭示細胞在不同生理條件下的行為和機制。在細胞治療研究中，Calcein AM用于標記治療性細胞，通過實時監測細胞在體內的存活和分布情況，優化細胞治療方案。

此外，Calcein AM還被用于細胞凋亡研究。在凋亡誘導實驗中，Calcein AM可以顯示細胞在凋亡過程中的熒光變化，幫助研究人員分析凋亡誘導劑的效果和凋亡發生的動力學特征。