材料

方法

1. LNP制備：通過微流控混合法，將脂質（ESM、膽固醇、可電離脂質、PEG-DMG）與mRNA在乙醇和緩沖液中混合，形成LNP。調控ESM/膽固醇與可電離脂質的摩爾比（RB/I）從9至0.43。

2. 表征：使用冷凍電鏡（cryo-TEM）解析LNP的納米結構，動態光散射（DLS）測定粒徑，BCA法測定蛋白吸附量，質譜分析蛋白冠組成。

3. 體外轉染實驗：在Huh7細胞中評估不同RB/I的LNP轉染效率。

4. 體內實驗：通過尾靜脈注射LNP至CD-1小鼠，使用SPECT/CT成像追蹤體內分布，評估脾臟、淋巴結等組織的轉染效率。

實驗結果

3.1 LNP的形態與結構：

通過冷凍電鏡（cryo-TEM）對不同RB/I（雙層脂質ESM/膽固醇與可電離脂質的摩爾比）的LNP進行觀察，結果發現：

RB/I=4：在此比例下，約84%的LNP呈現出典型的脂質體結構，其核心為電子致密的固態結構，懸浮于水性腔室中，并被完整的脂質雙層包裹。固態核心占據LNP內部空間的約30%，這一結構特征與預期相符，表明高比例的雙層脂質有助于形成穩定的脂質體形態。

RB/I降低：隨著RB/I值的降低，LNP的形態逐漸發生變化。當RB/I降至2.3及以下時，LNP開始呈現出部分脂質雙層包裹固態核心的結構，固態核心與脂質雙層之間的界面變得模糊，部分區域可見固態核心直接暴露于水性環境中。這一現象表明，雙層脂質的比例對LNP的形態具有決定性影響。

Fig. 1 | Morphological and in vitro transfection properties of LNP mRNA systems formulated using various bilayer lipid to ionizable lipid molar ratios (RB/I).

3.2 體外轉染效率：

在Huh7細胞中評估不同RB/I的LNP轉染效率，結果顯示：

高效轉染：RB/I=4-0.67的LNP在Huh7細胞中表現出高效的轉染能力，其轉染效率顯著高于Onpattro樣配方（RB/I≈1）。特別是在RB/I=4時，轉染效率達到最高，這一結果驗證了脂質體結構對提升轉染效率的積極作用。

轉染效率與形態的關系：轉染效率與LNP的形態密切相關。具有完整脂質雙層結構的LNP（RB/I=4）展現出最高的轉染效率，而隨著脂質雙層結構的破壞（RB/I降低），轉染效率也隨之下降。這一發現進一步強調了脂質體結構在mRNA遞送中的重要性。

3.3 體內分布與轉染效率：

通過尾靜脈注射LNP至CD-1小鼠，并使用SPECT/CT成像追蹤體內分布，結果顯示：

長循環特性：與Onpattro樣配方相比，RB/I=4的脂質體LNP在血液循環中的半衰期顯著延長（約15倍）。這一長循環特性歸因于脂質體結構降低了血漿蛋白的吸附，從而減少了單核-巨噬細胞系統（MPS）的清除。

肝外組織轉染：脂質體LNP在脾臟和腹股溝淋巴結的轉染效率分別提高了50倍和150倍。此外，在心臟、乳腺、胰腺等組織中也觀察到了顯著的mRNA表達。這一結果表明，脂質體LNP具有廣泛的組織分布能力，為實現肝外組織的mRNA遞送提供了可能。

3.4 蛋白冠分析：

通過質譜分析比較脂質體LNP與Onpattro樣LNP的蛋白冠組成，結果顯示：

蛋白總量減少：脂質體LNP的蛋白冠總量比Onpattro樣LNP減少了約2倍。這一減少主要歸因于脂質體結構降低了血漿蛋白的吸附。

特定蛋白吸附降低：在脂質體LNP的蛋白冠中，免疫球蛋白Ighv10-1和纖維蛋白原Fgb的吸附顯著降低。這些蛋白的減少有助于降低MPS的識別和清除，從而延長LNP在血液循環中的時間。

蛋白組成變化：脂質體LNP的蛋白冠中，免疫蛋白比例減少了4.4%，而載脂蛋白比例增加了3.6%。這種組成變化可能有助于LNP在血液循環中的穩定性和靶向性。

3.5 包封和轉染過程及相關機制：

討論

本研究通過調控雙層脂質與可電離脂質的摩爾比，成功開發了一種具有脂質體形態的長循環LNP-mRNA遞送系統。該系統不僅顯著降低了血漿蛋白吸附，延長了血液循環半衰期，還在脾臟和淋巴結等肝外組織中實現了高效的轉染。這一突破為mRNA療法在肝外疾病治療中的應用提供了新的可能性。

未來的研究將進一步探索該系統在其他肝外組織中的轉染效率，并優化LNP的配方和制備工藝，以提高其穩定性和安全性。

參考文獻：Cheng, Miffy Hok Yan, et al. "Liposomal lipid nanoparticles for extrahepatic delivery of mRNA." Nature Communications 16.1 (2025): 4135.