細胞的應(yīng)力松弛測試是研究其粘彈性行為的重要手段，通過觀察細胞在恒定形變下應(yīng)力隨時間衰減的過程，可以量化細胞骨架的彈性恢復(fù)能力和粘性耗散特性。以下是詳細的測試方法說明，涵蓋實驗技術(shù)、操作流程、數(shù)據(jù)分析和注意事項：

一、常用實驗技術(shù)

1. 原子力顯微鏡（AFM）/ 納米壓痕

• 原理：利用納米級探針施加局部壓縮或拉伸形變，通過檢測探針偏轉(zhuǎn)測量應(yīng)力。

• 步驟：

1. 探針校準(zhǔn)：選用球形探針，通過力-距離曲線校準(zhǔn)彈性系數(shù)。

2. 細胞固定：將細胞培養(yǎng)在軟基底（如PDMS凝膠）或剛性基底（如玻璃）。

3. 施加形變：探針以恒定速度壓入細胞表面至預(yù)設(shè)深度（如500 nm），保持形變恒定。

4. 記錄應(yīng)力衰減：監(jiān)測探針受力隨時間的變化（通常持續(xù)10秒至5分鐘）。

5. 數(shù)據(jù)處理：扣除基底效應(yīng)，將探針受力轉(zhuǎn)化為細胞應(yīng)力。

2. 微管吸吮（Micropipette Aspiration）

• 原理：通過負(fù)壓吸引細胞膜進入微管，測量吸入長度對應(yīng)的應(yīng)力變化。

• 步驟：

1. 微管制備：玻璃微管拉制為直徑2-5 μm的，內(nèi)充培養(yǎng)基。

2. 細胞吸附：通過微弱負(fù)壓將細胞吸附于微管口。

3. 施加形變：增加負(fù)壓使細胞膜吸入微管至固定長度（如10 μm），維持吸入長度。

4. 應(yīng)力監(jiān)測：通過壓力傳感器記錄負(fù)壓隨時間衰減（反映細胞應(yīng)力松弛）。

5. 模型擬合：常用液體滴模型（Liquid Drop Model）分析細胞膜張力。

3. 光學(xué)鑷子（Optical Tweezers）

• 原理：利用激光捕獲微珠，通過微珠位移施加形變并測量反作用力。

• 步驟：

1. 微珠功能化：將微珠（如聚苯乙烯）包被細胞黏附分子（如纖連蛋白）。

2. 細胞-微珠結(jié)合：將微珠與細胞表面受體結(jié)合，形成力學(xué)連接。

3. 施加形變：移動激光焦點拉伸細胞至固定位移。

4. 力衰減記錄：通過微珠布朗運動分析光阱剛度，計算作用力衰減。

5. 時間分辨率：適用于毫秒級快速松弛過程的觀測。

4. 微流控壓縮裝置

• 原理：通過微通道結(jié)構(gòu)或可變形膜對細胞施加均勻壓縮形變。

• 步驟：

1. 細胞加載：將細胞懸浮液注入微流控芯片。

2. 壓縮控制：通過氣壓或機械驅(qū)動使柔性膜變形，壓縮細胞至固定體積。

3. 壓力監(jiān)測：集成壓阻傳感器實時記錄壓縮力衰減。

4. 高通量優(yōu)勢：可同時測試多個細胞，適用于統(tǒng)計力學(xué)分析。

二、實驗流程關(guān)鍵步驟

1. 細胞準(zhǔn)備與活性控制

• 培養(yǎng)條件：使用含血清培養(yǎng)基維持細胞活性，實驗全程在37°C、5% CO?環(huán)境中進行。

• 基底選擇：

• 軟基底（如1-10 kPa凝膠）：模擬體內(nèi)微環(huán)境，減少邊界效應(yīng)。

• 硬基底（如玻璃）：簡化力學(xué)模型，適合高精度AFM測試。

2. 形變施加的注意事項

• 加載速率：形變施加需足夠快（如1-10 μm/s），避免在加載階段引入粘性響應(yīng)。

• 形變量控制：

• 小形變（<10%應(yīng)變）：保證線性粘彈性響應(yīng)。

• 大形變（>20%應(yīng)變）：研究非線性行為（如細胞骨架重構(gòu)）。

3. 數(shù)據(jù)采集與降噪

• 采樣頻率：

• 快速松弛（<1秒）：kHz級采樣（如光學(xué)鑷子）。

• 慢速松弛（>10秒）：1-10 Hz采樣（如AFM）。

• 噪聲處理：

• 使用低通濾波器消除高頻振動噪聲。

• 多次重復(fù)實驗取平均值（至少10個細胞）。

三、數(shù)據(jù)分析與模型擬合

1. 應(yīng)力松弛曲線特征

四、應(yīng)用案例與注意事項

1. 疾病研究示例

• 癌細胞應(yīng)力松弛：轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞（MDA-MB-231）相比正常乳腺細胞（MCF-10A）表現(xiàn)出更快的應(yīng)力松弛（?τ更小），提示細胞骨架動態(tài)性增強。

2. 常見問題與解決

• 細胞脫離基底：

• 對策：增加黏附蛋白（如膠原涂層）或降低加載力。

• 應(yīng)力衰減：

• 原因：實驗時間不足或細胞骨架高度交聯(lián)。

對策：延長記錄時間至平衡態(tài)，或驗證模型是否需引入G∞項。
儀器漂移

儀器漂移：

• 對策：在無細胞區(qū)域進行基線校正，使用溫控系統(tǒng)減少熱漂移。

五、前沿技術(shù)拓展

• 活細胞成像結(jié)合力學(xué)測試：

• 使用熒光標(biāo)記細胞骨架（如F-actin、微管），同步觀測力學(xué)松弛與結(jié)構(gòu)重組。

• 高通量微流控芯片：

• 集成數(shù)百個微腔體，并行測試細胞群體力學(xué)異質(zhì)性。

• 動態(tài)力譜（DFS）：

• 在不同加載速率下測試，揭示能量勢壘與分子鍵動力學(xué)。

通過以上方法，研究者能夠精確量化細胞的應(yīng)力松弛特性，為理解細胞力學(xué)在生理與病理過程中的作用提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

pavone納米壓痕細胞松弛測試

使用pavone納米壓痕保持深度不變；保持2s;上圖為load-indentation曲線；下圖為load-time曲線