核苷由堿基及核糖構成，是生物體內用于合成遺傳物質（DNA和RNA）的重要原料！除8種常見核苷外，還存在多種天然修飾核苷以及經(jīng)過結構優(yōu)化的化學合成的修飾核苷。修飾核苷主要用作各類核苷類藥物（抗癌藥物等）的研發(fā)以及作為合成小核酸藥物的原料等。
01
隨著瑞德西韋被FDA批準為治療的藥物，核苷類藥物以及相關衍生藥物再次受到醫(yī)學界的廣泛關注，它是臨床上用于治療病毒感染性疾病、腫瘤、艾滋病等的一類重要的藥物。
在藥物研發(fā)的進程中，為了提升核苷類分子的藥動學和藥效學性質，常針對核苷的堿基、糖苷鍵、糖環(huán)等進行修飾，從而降低核酸類藥物的免疫原性并提升穩(wěn)定性，經(jīng)常需要開發(fā)對應的雜質分析和原料檢測方法。
案例1：對胞磷膽堿鈉及相關化合物分析
色譜條件
色譜柱：Gemini 5µm NX-C18, 4.6×250mm
流動相：磷酸三乙胺緩沖液
流速：0.5mL/min
柱溫：30℃
進樣量：20µL
波長：276nm
02
假尿苷（Pseudouridine）是RNA上豐富的修飾核苷，又被稱為RNA的“第五種核苷"。2005年，Katalin Karikó等人發(fā)現(xiàn)將假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性隨著假尿苷引入比例的增高而降低。2008年，Katalin Karikó等人還發(fā)現(xiàn)用假尿苷替代尿苷的mRNA不僅能極大地降低mRNA的免疫原性，還能提高mRNA的穩(wěn)定性并增強其翻譯能力。2015年，Oliwia Andries等人發(fā)現(xiàn)用N1-甲基假尿苷替代尿苷比用假尿苷替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增強mRNA的蛋白表達能力。
這些研究提示，將假尿苷或N1-甲基假尿苷引入mRNA或許能有效降低mRNA疫苗的免疫原性，增強mRNA的穩(wěn)定性，且增強其蛋白表達能力。
我們在IVT反應過程中，對反應體系中各種有效組分進行實時監(jiān)控非常關鍵。
案例2：幾種三磷酸尿苷的類似物用液相色譜法快速檢測
色譜柱：Kinetex Biphenyl 100?（3.0×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4622-Y0
流動相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸調節(jié)pH至7.8）
流動相B：甲醇
流速：0.5mL/min
檢測器：260nm
柱溫：40℃
自動進樣器溫度：8℃
| 時間（min） | A（%） | B（%） |
| 0 | 85 | 15 |
| 20 | 75 | 25 |
| 20.1 | 85 | 15 |
| 25 | 85 | 15 |
圖1. Kinetex Biphenyl上3種類似物混標丨譜圖
因為三個類似物的結構高度相似，特別是UTP和Me-pUTP，疏水性極為相似，用普通的C18反相色譜柱難以分離。通過色譜柱篩選，我們發(fā)現(xiàn)Kinetex Biphenyl核殼固定相由于芳香族特殊的選擇性，可以對幾種同系物分離，該方法可以用于反應體系中組分的快速檢測。
我們再展開一下
03
mRNA藥物生產(chǎn)工藝大致可分為5個模塊：質粒生產(chǎn)、質粒線性化、體外轉錄合成反應（IVT）、mRNA純化、LNP包封。針對mRNA的批量合成，目前較為高效的方式為體外轉錄（In Vitro Transcription, IVT）。IVT是一個相對復雜的酶催化過程，在合成mRNA的過程中，除DNA模板外，需加入所需的酶、三磷酸核苷酸及其它相關試劑。
三磷酸核苷酸極性很強，在反相色譜上保留很弱，由于結構非常相似，不能實現(xiàn)良好分離。通過添加離子對試劑來增強三磷酸核苷在C18色譜柱上的保留并改善分離。
案例3：5種三磷酸核苷酸單體的IP-RP分離
色譜柱1：Biozen Oligo（4.6×150mm, 2.6μm）; P/N:00F-4790-E0
色譜柱2：Clarity Oligo-RP（4.6×150mm, 3μm）; P/N:00F-4441-E0
流動相A：150mM三乙胺+15mM正己胺（用磷酸調節(jié)pH至7.8）
流動相B：流動相A:乙腈（1:1）
流速：0.8mL/min
檢測器：260nm
柱溫：50℃
自動進樣器溫度：8℃
進樣量：1µL
| 時間（min） | A（%） | B（%） |
| 0 | 85 | 15 |
| 20 | 75 | 25 |
| 20.1 | 85 | 15 |
| 25 | 85 | 15 |
圖1. 色譜柱1 Biozen Oligo混標譜圖
圖3. 色譜柱2 ClarityOligo-RP混標譜圖
因為三磷酸核苷酸的親水性很強，在磷酸鹽緩沖體系下的保留偏弱，分離度也不好。在反相離子對條件下可以發(fā)現(xiàn)保留明顯增強，并且5個單體都可以很好的分離。
Biozen Oligo為2.6µm的核殼顆粒，跟3µm全多孔硅膠顆粒的Clarity Oligo-RP相比，可以看到峰更加尖銳，柱效和分離度更高；而后者的保留略強，峰的對稱性更好。
反相離子對色譜條件需要在流動相中添加烷基胺類離子對試劑，流動相的pH比較高。如果是傳統(tǒng)的硅膠顆粒C18柱，對壽命會有挑戰(zhàn)。Biozen Oligo 2.6µm和Clarity Oligo-RP 3µm兩款色譜柱均采用雜化硅膠技術，色譜柱可以耐受1-12的pH，更經(jīng)久耐用。
案例4：分離CTGA四個核苷酸
色譜柱：Venusil AQ C18 10µm 21.2×250mm
流動相：A: 水（50mM甲酸銨） B: 甲醇:水=20:80
流速：20ml/min
波長：260nm, 280nm
進樣量：1400µL（100mM單體CTGA各100µL混合后加流動相A 1mL）
| Time | B% |
| 0 | 0 |
| 11 | 0 |
| 20 | 100 |
Agela AQ C18 10µm填料，用甲酸銨的方法可以分離CTGA四個核苷酸。
案例5：改性核苷酸樣品制備
儀器：Agela Astra中壓制備系統(tǒng)
色譜柱：Flash HILIC 20-35μm 100? 4g四支串聯(lián)
流動相：A: 水（25mM乙酸銨） B: 乙腈:水=75:25（25mM乙酸銨, pH6.7）
流速：15ml/min
檢測波長：260nm; 220nm
進樣量：20mg
| Time | B% |
| 0 | 100 |
| 40 | 87 |
繼續(xù)皮一下，
彩蛋依舊是熱點應用分享
1
對五種關鍵核苷進?了全?HPLC分析：腺苷、?苷、尿苷、胞嘧啶和N6-甲基腺苷（m6A）。?譜峰顯?了不同的保留時間，說明了HPLC在分析核苷和修飾形式??的多功能性【1】。
2
生物素化寡脫氧核苷酸的合成純化
紫外線誘導的6-4TT聚合后用Venusil MP C18醋酸銨體系純化，采用UHPLC-Q-TOF/MS對制備的含ODN的6-4TT進行表征和堿性穩(wěn)定性驗證。生物素化的含6-4TT的寡脫氧核苷酸被用于篩選針對6-4TT光產(chǎn)物的高親和力抗體。預計該合成的探針可用于檢測與該病變結合的蛋白質并評估6-4TT DNA螺旋構象的影響【3】。
“
3
（化學）酶促合成是傳統(tǒng)化學方法的寶貴替代方案，但由于生物催化劑的生產(chǎn)成本過高，降低了此類工藝的可行性。然而在連續(xù)酶膜反應器（EMR）中可以提高生物催化劑使用率直到其失活，因此它們?yōu)槭褂米杂扇芙獾拿高M行間歇酶促反應提供了一種有價值的替代方案。在EMR中，酶通過合適的膜保留在反應器中。因此，可以避免載體材料上進行固化，以及酶活性的相關損失。使用自由溶解酶的EMR應用，有助于集成生物催化劑分離的連續(xù)過程，從而降低生物催化劑的總體成本并增強核苷生產(chǎn)的下游加工【2】。
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