百歐博偉生物：菌種保藏使微生物的代謝活動處于的狀態，但又不至于死亡，從而達到保藏的目的。規范菌種原始菌液的制備及長期保存。

1、定義

原始菌液--由凍干菌或冷凍菌直接傳代的孢子或生長菌的原始懸浮液。

工作菌液--由原始菌液直接稀釋，或根據一般試驗需要而等量稀釋的特定濃度的孢子或細菌的懸浮液。

2、總則

微生物室收到實驗菌種后應進行活化及純化，并進行傳代（芽孢桿菌除外）。每一新菌種在適宜的瓊脂平板上劃線分離，檢查是否純種，觀察菌落形態并用革蘭氏染色或芽孢染色法進行鏡檢，如果是芽孢懸浮液，用常規方法測定其存活孢數。

經檢查如果滿意，貼上合適的標簽，并將貯備菌存放在實驗室專用的冰箱里（2 ～8℃）或冷凍室內，以避免與實驗室正在使用的其它菌種相混淆，作好菌種傳代的記錄以便能追蹤傳代史。

生孢梭菌的孢子懸浮菌應每年制備一次。

原始菌種的傳代次數最多傳至第五代。

一、培養基

凍干菌制備原始菌液

由甘油冷凍菌制備原始菌液

1、把凍干菌加入100ml液體培養基后所得的菌作為代。

2、從冷凍箱內取出冷凍菌，使其在室溫下慢慢融化；

3、把冷凍菌無菌轉移至100ml該菌所適用的液體培養基中；

4、根據菌種的類型，將接種后的培養基在適當溫度下培養24h或更長一些時間；

5、把甘油冷凍菌加入100ml液體培養基后所得的菌作為第二代。

二、由集菌平板制備原始菌液

1、在超凈工作臺內，把經過24h（或更長時間）培養的菌液搖勻，各取1ml，無菌轉移至5只培養基平板上，輕輕轉動平板，使菌液均勻分布于平板表面。不同培養基適用于不同菌種。

2、另用一只平板，劃線分離菌液，培養之，以檢查菌液是否純種。

在適當的溫度下培養以上平板，不同菌種所需培養周期不一。

1、生長菌-24h以內即可顯見增長；

2、孢子-需要3～7天或更長時間才能得到50%孢子，這樣可確保提到濃的懸浮液。對需長時間培養或培養溫度較高（55℃）的平板進行適當密封，以免培養基失水干裂。

3、分生孢子，一般需要5～14天才能獲得明顯的分生孢子生長物，將平板封口，以免分生孢子污染空氣。

4、在超凈工作臺內，各取約0ml氯化鈉磷酸緩沖液（PBS）加至經培養后的集菌平板內。

5、用彎曲的接種棒（或無菌玻璃彎頭）輕輕地刮平板表面，使菌落與平板分離。但注意不要劃破培養基。傾斜平板，使菌懸液集中于平板一端，用無菌注射器或無菌吸管吸取菌懸液，把5只平板中的菌懸液收集于一只大小合適，便于封口的試管中。

三、標記

在原始菌液的標簽上記述下列內容：

1、菌種名稱

2、原始菌種制備編號（代數+制備日期）

3、有效期（孢子懸浮液的有效期為一年）

4、操作者姓名（菌液濃度一經標定后，即應補記在標簽上）

四、原始菌液的濃度標定

1、標定孢子初始制備液的濃度并進行記錄，以后，每次使用該原始菌液時，不論直接使用或用其配制工作菌液，都應事先重新標定其濃度。前一次標定濃度僅供參考；

2、除非有定量要求，一般生長態菌的原始菌液無需標定，生長菌很易死亡，因此不能保持穩定可靠的濃度。

五、菌種的斜面保存

1、經常使用的菌種。將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2℃～8℃的冰箱中保藏。

2、保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月，移種一次。酵母菌兩個月，細菌每月移種一次。

六、菌液甘油冷凍管保存

1、將液體培養基培養或固體培養基培養制備的剩余原始菌液中加入足量的無菌甘油得到10%甘油液。輕輕振搖，使其充分混合；

2、各取0ml上述混合液，無菌分裝于10支冷凍用小試管或冷凍管中，在管子上注明菌種名稱、菌種號等以及從冷凍日起2年的有效期。做好記錄，并妥善保存。

3、制備好的菌液甘油冷凍管在-80℃超低溫或液氮罐內貯存。

七、液體石蠟管的保藏

1、將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃滅菌30min，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。

2、將菌種接種在新鮮瓊脂斜面中，并在相應的適宜條件下培養（培養時間一般為24h）；

3、在超凈工作臺下無菌操作，用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養好的菌種管內，并使石蠟高出菌種表面約1cm，再將菌種管于2℃～8℃保藏。

4、將試管直立，置低溫或室溫下保存。

5、液體石蠟保藏菌種有效期為一年。

八、注意事項

1、每天應檢查菌種保藏室或冰箱的溫濕度狀況，并用專用記錄本記錄

2、經常檢查菌種管的塞子是否松動，如有異常應及時處理

3、經多次傳代的菌種，應定期檢查其純度及其變異性（與原始記錄相比較），若有異常，應更換新菌種

4、帶有實驗菌的廢棄物和超過有效期的菌種，121℃高壓滅菌后按有關規定銷毀，并認真填寫"檢定菌液使用、銷毀記錄表。

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