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葡萄球菌A蛋白(SPA)在免疫組化中的應(yīng)用

來(lái)源:上海源葉生物科技有限公司   2012年07月14日 10:43  

SPA可為多種示蹤物(如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白)所標(biāo)記,應(yīng)用較廣泛的為酶標(biāo)記SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP,可應(yīng)用于間接法染色,SPA在PAP法中可代替橋抗體。

1.SPA—HRP在間接法中的應(yīng)用
由于SPA能結(jié)合IgG的Fc段,因此就成為天然的抗IgG,酶標(biāo)記的SPA可代替酶標(biāo)記的IgG抗血清,從而測(cè)定和定位組織內(nèi)的IgG或免疫復(fù)合物,SPA—HRP的染色步驟如下。
(1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
(2)3%H202處理15min,以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶
(3)TBS洗3X3min。
(4)加*抗體,孵育30~60min,或4~C過(guò)夜。
(5)TBS洗3X 3min。
(6)加適當(dāng)?shù)南♂尩腟PA—HRP(1:100~1:400),孵育30—60min。
(7)TBS洗3X3min。
(8)DAB顯色5—10min。
(9)復(fù)染、脫水、封片。

2.SPA在PAP法中的應(yīng)用
SPA除與標(biāo)記物結(jié)合后用于代替第二抗體外,其本身可作為橋抗體用于PAP染色。與標(biāo)記SPA相似,SPA可與多種動(dòng)物的*抗體反應(yīng)外,還可與多種PAP復(fù)合物反應(yīng),而不像PAP法需要與*抗體相同的動(dòng)物制備的各種PAP復(fù)合物。由于SPA與Fc段和Fab段結(jié)合為親和化學(xué)反應(yīng),不是抗原—抗體的免疫反應(yīng),因而反應(yīng)極為迅速,能大大減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。此法的敏感性不如PAP法,但背景染色要低于PAP法,而且較為方便。染色步驟如下。 (1)4gm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,PBS洗3X3rain。
(2)IHC的前處理視特異性一抗不同,可采用蛋白酶消化或熱誘導(dǎo)的微波抗原修復(fù)(AR)。
(3)PBS洗3X3min。
(4)3%過(guò)氧化氫(Hz02)孵育10min(可省略),以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。
(5)PBS洗3X3min。
(6)20%蛋清[用0.01mol/L(pH7.3)PBS配制]孵育20min。
(7)PBS洗3X3min。
(8)10%非免疫性動(dòng)物血清孵育10min(可省略),以減少非特異性背景,無(wú)需沖洗,只需吸去多余血清。
(9)滴加適當(dāng)稀釋的*抗體,37~C溫育60min,或4~C過(guò)夜。
(10)PBS洗3X 3rain。
(11)加SPA(1ug/mi),37~C溫育30rain。
(12)PBS洗3X3rain。
(13)PAP復(fù)合物(兔或鼠)37~C溫育30min。
(14)PBS洗3X3rain。
(15)0.04%DAB(含0.03%Hz02)顯色5~10min
(16)復(fù)染,脫水,常規(guī)樹(shù)膠封固,結(jié)果觀察。

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