Illumina MS-102-3003（MiSeq Reagent Kit v3）基因測序試劑盒用戶指南

一、產品概述

Illumina MS-102-3003（MiSeq Reagent Kit v3） 是專為Illumina MiSeq測序平臺設計的高性能測序試劑盒，采用邊合成邊測序（Sequencing-by-Synthesis, SBS）技術，支持長達600個循環的測序反應，單次運行可生成高達15 Gb的數據輸出，適用于全基因組重測序、轉錄組分析、宏基因組學及靶向測序等應用場景。

二、核心性能參數

• 測序循環數：600次（支持150次循環格式用于計數應用）

• 數據輸出：最大15 Gb（600循環）或3.8 Gb（150循環）

• 讀長：雙端測序（Paired-End）支持2×300 bp

• 讀數數量：單次運行最多可生成2500萬條序列

• 系統兼容性：適用于研究模式下的MiSeqDx、MiSeq FGx及標準MiSeq系統

三、技術原理

SBS技術通過以下步驟實現測序：

1. 堿基延伸：DNA聚合酶催化dNTP（脫氧核苷酸）與模板鏈互補配對。

2. 熒光激發與信號收集：每個dNTP攜帶可逆終止基團及熒光標記，經激光激發后發射特定波長熒光，信號由光學系統捕捉。

3. 終止基團切除：熒光信號收集后，化學試劑切除終止基團，恢復鏈延伸能力。

4. 循環重復：上述步驟循環進行，直至完成測序長度。

試劑盒改進：

• 優化化學配方提升簇密度和片段長度，Q30得分（質量值≥30的堿基比例）顯著提高。

• 即用型預裝試劑盒設計，減少人為操作誤差。

四、操作流程

1. 文庫制備

• 使用文庫構建試劑（如TruePrep RNA Library Prep Kit for Illumina）生成測序文庫。

• 通過Qubit定量儀確定文庫濃度，稀釋至4 nM后用NaOH變性。

2. 試劑盒準備

• 從-20℃冰箱取出試劑盒，室溫解凍后顛倒混勻。

• 準備冰水混合物（冰:水=3:1）預冷雜交緩沖液（HT1）。

3. 上機前處理

• 將變性文庫與預冷HT1混合，稀釋至20 pM終濃度。

• 添加PhiX質控DNA（5%比例）以監控測序質量。

4. 測序運行

• 創建Sample Sheet文件，定義樣本信息及運行參數。

• 啟動MiSeq測序儀，選擇“Sequence”模式并加載試劑盒。

• 建議初始上機濃度為4 pM，后續可根據結果調整至8 pM。

五、應用場景與優勢

• 全基因組重測序：適用于人類、動植物及微生物基因組的變異檢測。

• 轉錄組分析：定量基因表達水平，解析基因調控網絡。

• 宏基因組學：分析環境樣本中的微生物群落多樣性。

• 靶向測序：聚焦特定基因或區域，支持精準醫療研究。

優勢：

• 高通量：單次運行生成15 Gb數據，支持大規模基因組研究。

• 長讀長：2×300 bp讀長提升復雜基因組區域解析能力。

• 高質量：改進試劑配方提升測序準確性（Q30得分）。

• 兼容性強：適配多種MiSeq測序系統，研究模式靈活。

六、注意事項

1. 試劑儲存：試劑盒需在-20℃保存，解凍后避免反復凍融。

2. 文庫質量：確保文庫片段分布均勻，避免小片段（<100 bp）過量導致測序失敗。

3. 上機濃度：初始建議使用4 pM，過高濃度可能導致簇密度過高而信號飽和。

4. 設備維護：測序前需檢查儀器狀態，避免因硬件故障導致數據丟失。

七、數據解讀

• 質量值（Q值）：Q30得分反映堿基識別準確性，≥80%為合格標準。

• 覆蓋度：目標區域測序深度需≥30×以確保變異檢測可靠性。

• 生物信息學分析：推薦使用Illumina BaseSpace平臺或第三方工具（如BWA、GATK）進行數據處理。

八、供貨信息與支持

• 產品貨號：MS-102-3003

• 供應商：Illumina授權代理商（如華雅思創生物科技有限公司）

• 技術支持：聯系供應商獲取實驗設計、數據分析及儀器維護咨詢。

通過本指南，科研人員可快速掌握Illumina MS-102-3003試劑盒的使用方法，為基因組學研究提供高效、準確的測序解決方案。如需進一步技術文檔或培訓，請訪問Illumina網站或聯系當地代理商。