甘油三酯是由3個(gè)脂肪酸和甘油組成的三酯，是動(dòng)物和植物體內(nèi)脂肪的主要成分。甘油三酯中存在的脂肪酸類(lèi)型幾乎涵蓋了所有已知的天然脂肪酸。多種脂肪酶可以釋放這些脂肪酸，隨后被用于能量產(chǎn)生或其他目的。AkrivisBio的甘油三酯檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單、靈敏的甘油三酯測(cè)量方法，適用于多種生物樣本。甘油三酯含量可以通過(guò)比色法（最大吸收波長(zhǎng)570納米）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)535/587納米）進(jìn)行測(cè)定。比色法的檢測(cè)范圍為每孔0-10納摩爾，熒光法的靈敏度下限為1-5皮摩爾。

艾美捷甘油三酯測(cè)定試劑盒：

貨號(hào)：MA-0110

規(guī)格：100孔

樣本類(lèi)型：組織提取液、細(xì)胞裂解液、血清、血漿、尿液

適用物種：通用（適用于所有物種）

檢測(cè)方法：比色法，檢測(cè)波長(zhǎng)570納米；或熒光法，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)=535/587納米

檢測(cè)類(lèi)型：定量

應(yīng)用：基于微孔板的比色法/熒光法檢測(cè)，用于測(cè)量樣本中的甘油三酯水平。比色法檢測(cè)范圍為0-10納摩爾/孔，熒光法檢測(cè)范圍為1-5皮摩爾/孔。

靈敏度：<1微摩爾

儲(chǔ)存條件：-20°C

運(yùn)輸條件：凝膠冷藏包

甘油三酯測(cè)定試劑盒檢測(cè)組分：

-檢測(cè)緩沖液：25毫升，貨號(hào)WMMA-0110-A

-ADHP溶液：200微升，紅色，貨號(hào)MA-0110-B

-脂肪酶：凍干粉，藍(lán)色，貨號(hào)MA-0110-C

-甘油氧化混合液：凍干粉，綠色，貨號(hào)MA-0110-D

-甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：0.3毫升，黃色，貨號(hào)MA-0110-E

甘油三酯測(cè)定檢測(cè)原理：

1.單酯、二酯和三酯甘油被脂肪酶水解，生成游離脂肪酸和游離甘油。

2.甘油被氧化，生成化學(xué)計(jì)量的過(guò)氧化氫。

3.過(guò)氧化氫和我們的ADHP探針作為過(guò)氧化物酶的底物，產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色和熒光。

用戶(hù)自備材料：

-0.1-0.5%無(wú)過(guò)氧化物的洗滌劑溶液

儲(chǔ)存和處理：

將試劑盒儲(chǔ)存于-20°C。使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫。打開(kāi)試劑瓶前請(qǐng)短暫離心，以使可能粘附在蓋子上的組分脫落。

-ADHP溶液：DMSO在略低于室溫時(shí)會(huì)凍結(jié)。使用前必須恢復(fù)至室溫。儲(chǔ)存于-20°C。

-脂肪酶：用220微升檢測(cè)緩沖液溶解。分裝后儲(chǔ)存于-20°C。

-甘油氧化混合液：用220微升檢測(cè)緩沖液溶解。最好分裝后儲(chǔ)存于-20°C，以避免反復(fù)凍融。

-甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品：在冷凍時(shí)可能會(huì)沉淀。為了重新溶解，將試劑瓶放入熱水（80-100°C）中加熱，直至溶液變得渾濁（2-3分鐘）。在加熱時(shí)渦旋混合，這將使其冷卻并再次變?yōu)槌吻迦芤骸Ｖ貜?fù)加熱/冷卻一次。標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)在可以使用。

檢測(cè)步驟：

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：

-比色法檢測(cè)：將40微升甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品加入160微升檢測(cè)緩沖液中。將0、10、20、30、40、50微升分別加入96孔板的多個(gè)孔中，用檢測(cè)緩沖液將孔體積調(diào)整至50微升。各孔分別含有0、2、4、6、8、10納摩爾的甘油三酯。

-熒光法檢測(cè)：將10微升甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品加入490微升檢測(cè)緩沖液中。將0、10、20、30、40、50微升分別加入多個(gè)孔中，分別得到0、200、400、600、800、1000皮摩爾的甘油三酯。由于熒光法的靈敏度較高，可以通過(guò)進(jìn)一步稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使用0-200皮摩爾范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.樣本準(zhǔn)備：

-使用100微升無(wú)過(guò)氧化物的洗滌劑溶液裂解10?細(xì)胞。將10毫克組織在100微升洗滌劑溶液中勻漿。勻漿液/細(xì)胞裂解液應(yīng)像標(biāo)準(zhǔn)品一樣經(jīng)歷加熱/冷卻循環(huán)。體液（血清、腦脊液、唾液等）可以直接使用。將每種樣本加入至96孔板的孔中，每種樣本加入50微升，成對(duì)加入，其中一對(duì)作為背景對(duì)照。如果最終樣本讀數(shù)不在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍內(nèi)，應(yīng)適當(dāng)稀釋并重新運(yùn)行。

-有時(shí)基質(zhì)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致背景值較高和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率變淺，這是由于試劑盒中酶的活性發(fā)生改變。在這種情況下，最好向成對(duì)測(cè)試樣本中的一個(gè)加入2-4納摩爾的甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)。兩個(gè)樣本之間的吸光度差異可用于確定未知甘油三酯含量與加入標(biāo)準(zhǔn)品的比例。

3.樣本水解：

-向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔中加入2微升脂肪酶。背景對(duì)照孔不加脂肪酶。讓水解反應(yīng)進(jìn)行20-30分鐘。

4.甘油氧化：

-根據(jù)要測(cè)量的孔數(shù)準(zhǔn)備足夠的甘油氧化混合液，每個(gè)孔需要50微升。

-反應(yīng)混合液：

-比色法：檢測(cè)緩沖液46微升，ADHP溶液2微升，甘油氧化混合液2微升。

-熒光法：檢測(cè)緩沖液47.8微升，ADHP溶液0.2微升，甘油氧化混合液2微升。

-向含有甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和背景對(duì)照的每個(gè)孔中加入50微升反應(yīng)混合液。充分混合。在室溫下孵育30-60分鐘（60分鐘效果稍好），避光。或者，可以在反應(yīng)進(jìn)行時(shí)用微孔板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。能夠觀(guān)察反應(yīng)動(dòng)力學(xué)通常可以提供所需的見(jiàn)解。

5.測(cè)量：

-通過(guò)比色法（570納米吸光度）或熒光法（激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)535/587納米）監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)不再變化時(shí)，反應(yīng)完成。達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間應(yīng)少于60分鐘。

6.典型結(jié)果：

7.計(jì)算：

-從所有標(biāo)準(zhǔn)品讀數(shù)中減去0標(biāo)準(zhǔn)品的讀數(shù)。繪制校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。確定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。斜率決定了OD/納摩爾或熒光/皮摩爾。對(duì)于吸光度大于約1OD的值，吸光度曲線(xiàn)有明顯的凸性。熒光法檢測(cè)中也觀(guān)察到類(lèi)似的凸性。將數(shù)據(jù)擬合到二階多項(xiàng)式比直線(xiàn)擬合能更準(zhǔn)確地計(jì)算未知樣本的含量。

-從測(cè)試樣本的總吸光度中減去配對(duì)背景對(duì)照的吸光度，以確定未知樣本中的甘油三酯含量，然后根據(jù)原始細(xì)胞數(shù)量或組織質(zhì)量校正樣本稀釋度。

-A.測(cè)試樣本的原始吸光度-背景對(duì)照的吸光度=測(cè)試樣本的凈吸光度

-B.凈吸光度/標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率=樣本孔中的甘油三酯納摩爾數(shù)

-C.樣本孔中的甘油三酯納摩爾數(shù)/加入孔中的樣本微升數(shù)=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/微升

-D.樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/微升×加入樣本的洗滌劑溶液總體積=樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)

-E.樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量等）=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克（或細(xì)胞數(shù)量等）

-使用內(nèi)標(biāo)計(jì)算：

-A.（樣本+加入標(biāo)準(zhǔn)品）的吸光度-（僅樣本）的吸光度=內(nèi)標(biāo)的吸光度

-B.內(nèi)標(biāo)的吸光度/加入的標(biāo)準(zhǔn)品納摩爾數(shù)=OD/甘油三酯納摩爾數(shù)

-C.（僅樣本）的吸光度/OD/甘油三酯納摩爾數(shù)=測(cè)試樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)

-D.樣本中的總甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克組織（或細(xì)胞數(shù)量等）=樣本中的甘油三酯納摩爾數(shù)/毫克（或細(xì)胞數(shù)量等）