羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）是一種非必需亞氨基酸，主要存在于動物的膠原蛋白和彈性蛋白中。在植物細胞壁中，富含羥脯氨酸的蛋白質被用作糖鏈的附著點。羥脯氨酸在膠原蛋白中通過增強其機械穩定性發揮功能。在疾病狀態下（如肝纖維化、佩吉特病、骨轉移等），通過測量水解產物或血清和尿液中的羥脯氨酸水平，可以評估膠原蛋白的形成和代謝。

AkrivisBio的羥脯氨酸檢測試劑盒主要用于檢測蛋白質和組織水解產物中的羥脯氨酸。血清和尿液經過適當預處理后也可作為檢測樣本。該試劑盒提供了一種簡單的羥脯氨酸測量方法，生成的顯色劑可在550-565納米波長范圍內測量，適用于1-20微克膠原蛋白或約0.1-2微克羥脯氨酸的檢測。

艾美捷羥脯氨酸測定試劑盒#MA-0101檢測原理：

1.樣本在酸中c底水解。

2.羥脯氨酸被氯胺T氧化為吡咯。

3.吡咯隨后與艾氏試劑（Ehrlich’sReagent）反應生成顯色物質。

檢測試劑：

-氧化緩沖液：10毫升

-氯胺T濃縮液：0.6毫升

-酸/異丙醇溶液：5毫升

-DMAB濃縮液：5毫升

-羥脯氨酸標準品（1毫克/毫升）：0.1毫升

-微孔板封口膜：1張

用戶自備試劑和設備：

-12摩爾/升鹽酸

-96孔透明平底板

-烤箱或熱板

-聚丙烯試管

儲存和處理：

將試劑盒儲存于+4°C。使用前短暫離心小瓶。閱讀完整協議后再進行檢測。

-氯胺T試劑：每孔加入6微升氯胺T濃縮液至94微升氧化緩沖液中，混合均勻。

-DMAB試劑：每孔加入50微升DMAB濃縮液至50微升酸/異丙醇溶液中，混合均勻。

-注意：為獲得最佳結果，建議在2-3小時內使用稀釋后的試劑。

檢測步驟：

1.樣本準備：將樣本用100微升去離子水/10毫克組織勻漿化。在耐壓試管（如Nalgene微型試管）中加入等體積濃鹽酸（約12N，未提供），混合均勻后在120°C下水解3小時。尿液樣本也用等體積濃鹽酸處理并同樣水解。之后，尿液樣本需用活性炭（1毫克/50微升尿液/鹽酸混合物）處理，離心3分鐘以去除活性炭。將每個水解后的樣本10微升轉移到96孔板中，并在熱源和/或真空中蒸發至干燥。

-注意：內源性化合物可能干擾反應。為確保準確測定樣本中的羥脯氨酸，建議向樣本中加入已知量的標準品（0.4微克）。

2.標準曲線：將羥脯氨酸標準品稀釋至40微克/毫升，方法是將10微升1毫克/毫升的標準品加入240微升去離子水中，混合均勻。將0、5、10、15、20、25微升分別加入一系列孔中，每種濃度雙孔。這將得到一個0-0.2-0.4-0.6-0.8-1微克/孔的標準曲線。

3.氧化反應：向每個樣本和標準品孔中加入100微升氯胺T試劑，室溫下氧化反應5分鐘。

4.顯色反應：向每個孔中加入100微升DMAB試劑，蓋上孔板封口膜，在60°C下反應30-40分鐘，使顏色w全顯色。

-注意：氯胺T試劑和DMAB試劑密度差異大，不易混合。封板前，每個孔上下吸打2-3次以混合均勻。顯色反應在約30分鐘時達到最大值。如果反應時間過長，顏色會褪去。顏色在室溫下可保持穩定。

5.測量：在560納米處測量吸光度。

6.計算：從所有讀數中減去0微克羥脯氨酸標準品的吸光度值。繪制標準曲線。曲線的斜率定義了系統的靈敏度。將背景校正后的樣本讀數除以標準曲線的斜率，以確定測試孔中的羥脯氨酸量。通過以下步驟推算回原始樣本中的量：

-A.將孔中的羥脯氨酸量除以加入孔中的樣本體積（微升）=樣本中羥脯氨酸/樣本微升

-B.將樣本中羥脯氨酸/樣本微升乘以1中樣本的總體積=樣本中總羥脯氨酸

-C.將樣本中總羥脯氨酸乘以處理過程中產生的任何稀釋因子。

-D.將樣本中總羥脯氨酸除以處理前的組織毫克數或液體樣本體積=樣本中羥脯氨酸/組織毫克等。

-注意：許多代謝物和其他化學物質可能會顯著干擾各種反應化學。為了更精確的測定，在沒有樣本和有恒定量樣本的情況下進行標準曲線。沒有必要運行所有六個標準；使用最少的3個（0-10-20微升）來驗證吸光度響應是否與分析物量呈線性關系。兩個標準曲線的斜率應該相同。它們之間的吸光度偏差歸因于樣本中的分析物量（當前情況下的羥脯氨酸）。如果兩個斜率不同，則存在矩陣效應影響反應化學。在這種情況下，確定0標準之間的吸光度差異，并將其應用于在樣本存在的情況下運行的標準曲線的斜率。

具有大矩陣效應的樣品示例（右圖）：

0標準之間的差異為0.35。在樣本存在的情況下，斜率為0.226吸光度/微克。具有基質效應的樣本中羥脯氨酸的量為0.35吸光度/0.226吸光度/微克 = 1.55微克。