利用飛行時間核酸質譜定量檢測超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS
來源:聚光科技(杭州)股份有限公司
2025年03月28日 16:15
2024年11月4日,國際化學類頂級期刊《德國應用化學國際版》(Angewandte Chemie-international Edition)(IF 16.1)上發表了題為《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究論文。報道了一種 基于核酸質譜平臺的創新甲基化檢測方法 ,該工作由復旦大學醫學院胡璐璐研究員團隊、華山醫院消化科劉杰主任團隊、美國芝加哥大學何川院士團隊攜手柏锘(上海)醫療科技有限公司共同完成。
該研究中所使用的飛行時間質譜平臺為聚光科技生命科學板塊旗下聚致生物(GenWish)自主研發的GeneTOF 3100核酸質譜分析系統。 液體活檢技術通過收集血液中來自各種組織的游離DNA(cfDNA),對其中包含的生物標志物(如基因突變、甲基化或羥甲基等表觀修飾)進行檢測,具有無創、高效的特點。與傳統的各種檢測技術(例如胃腸鏡、血清標志物)相比,液體活檢在臨床上具有革命性的優勢,在癌癥等疾病的早篩早診、預后監測、療效評估等諸多方面有廣闊的應用前景。 DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾,可在腫瘤發生的早期被檢測到,且具有較好的穩定性,因此成為腫瘤液體活檢中一個生物標志物。 但是,目前基于亞硫酸氫鹽測序技術的甲基化檢測方法,很難避免DNA的降解;且高通量測序成本較高,實驗后的分析工作復雜;PCR檢測涵蓋的位點也有限,因此開發一種經濟、可靠、通量靈活且能夠覆蓋多位點的新甲基化檢測方法,是非常具有意義的。 研究團隊開發的LAMP-MS方法創造性地將線性擴增和飛行時間質譜技術結合在一起,只需要1ng血漿cfDNA,通過多重PCR和單堿基引物延伸,能夠在較短時間內同時檢測數十個甲基化位點。該技術主要操作步驟如圖1所示:
從血漿中提取1ng的cfDNA樣本,經過末端修復后,用含有甲基化雙鏈T7啟動子的DNA接頭進行連接;
進行亞硫酸氫鹽處理后,非甲基化的胞嘧啶(dC)轉化為尿嘧啶(dU),而甲基化的胞嘧啶(5mC)保持不變; 使用T7 RNA聚合酶進行無偏好性線性擴增,產生μg數量級的RNA產物; 通過序列特異性PCR對含有特定DNA甲基化位點的DNA片段進行指數擴增; 對特定的DNA片段進行文庫構建和淺測序(1~2G深度),稱為靶向LAMP-Seq,以確定5mC的化學計量; 利用位點特異性引物進行單堿基延伸,如果延伸位點配對的是ddATP,代表此處為未甲基化的C,如果是ddGTP則代表甲基化的5mC,通過相應的質譜峰計算 5mC/C 比值。
為驗證LAMP-MS方法的性能,研究團隊合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探針混合物,利用1ng的上述探針混合物對LAMP-MS方法進行測試。結果表明,LAMP-MS能夠準確地定量測量從0%到100%的5mC(圖2A),圖2B中標曲表明檢測準確性和理論值高度吻合。此外,文章表示,LAMP-MS在1ng探針混合物體系下的檢測限為5%的5mC的甲基化率(圖2B)。 圖2A 使用1ng 5mC探針驗證LAMP-MS方法的靈敏度和準確性 圖2B 使用1ng 5mC探針驗證LAMP-MS方法的靈敏度和準確性 在臨床上,來自癌癥患者血漿cfDNA樣本的生物標志物豐度因人而異,因此研究團隊進一步利用真實樣本對LAMP-MS方法進行了驗證。從10名結直腸癌患者和10名非結直腸癌患者中各獲取1ng的cfDNA樣本,檢測了結直腸癌篩查中有代表性的標志物——SEPTIN9基因的4個甲基化位點,發現LAMP-MS能夠準確測定四個 SEPTIN9 位點的 5mC 甲基化率,且結直腸癌組和非結直腸癌組之間存在顯著差異,與高通量測序結果有很好的一致性(圖3)。 圖3 在結直腸癌和非結直腸癌患者中驗證LAMP-MS方法 研究團隊認為,同樣的策略也可以拓展到RNA的定量檢測中,例如在大多數高等生物mRNA中含量豐富、并且對于生命過程起著重要調節作用的m6A修飾的檢測。 研究團隊將已發表的GLORI技術和核酸質譜有機整合成為m6A Mass Array方法。該方法從HELA細胞中提取mRNA,將未甲基化的腺嘌呤轉化為肌苷,甲基化的m6A則保留下來。經過末端修復、加接頭,再將mRNA反轉錄成cDNA,作為模板進行指數擴增,然后在m6A位點進行單堿基延伸,若延伸ddATP則對應檢測位點為m6A,ddGTP對應未甲基化的腺嘌呤。從而能夠計算出該位點的 m6A/A 比率。 對比HELA細胞mRNA中RXRA基因(100% m6A),TNFRSF10B基因(100% m6A)和FBXL19基因(53% m6A),及其各自鄰近的非甲基化腺嘌呤位點,證明該m6A核酸質譜方法能夠進行有效的RNA甲基化定量檢測(圖4) 。 綜上所述, LAMP-MS(及m6A MASS ARRAY方法)基于核酸質譜技術,可以實現超低量樣本的甲基化檢測,且結果可以直接可視化,不需要高通量測序繁復的數據分析處理過程 ; 該技術利用核酸質譜前處理體系,在單反應中可實現檢測多個5mC位點的檢測,且具有良好的特異性,在臨床上可用于同時篩查多種癌癥類型的標志物;并且,質譜檢測也具有靈敏度和精密度的特點,能夠在極低樣本量下提供高度可靠的分析結果,是低豐度變異標志物檢測的理想平臺;最后,核酸質譜通量靈活,無需湊樣,能夠從容應對大樣本量的臨床驗證工作或小樣本量的研究工作。 因此,LAMP-MS技術有潛力作為表觀遺傳學領域重要的實用工具,為科研工作者的實驗室研究和臨床樣本檢測提供了經濟且先進的應用方案。 GeneTOF系列核酸質譜分析系統是準確、經濟、高效的多重自動化基因檢測平臺,能夠在單反應中實現1~50個基因位點變異靶標的精確檢測,變異類型包括SNP突變、甲基化、拷貝數變異、基因融合、堿基插入/缺失等。在腫瘤防治、出生缺陷防控、藥物基因組、病原體檢測等領域具有廣泛的應用。 杭州聚致生物科技有限公司(簡稱“聚致生物”)創立于2021年,總部位于浙江杭州,是國內儀器裝備企業——聚光科技生命科學旗下子公司,專注于生物質譜類及相關儀器產品的研發、生產和推廣,致力于以先進分析技術推動生命科學研究和產業的發展,共建良好的產業生態。 聚致生物定位于上游儀器平臺供應商,以開放的態度同生命科學領域的專業機構合作,共同培育終端應用市場,造福人類的美好生活。
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